非洲豬瘟病毒P30蛋白在昆蟲細胞中的表達

李 林，任煒杰，鄒艷麗，吳曉東，劉 珊，張永強，劉春菊，王志亮

(中國動物衛生與流行病學中心國家外來動物疫病診斷中心，山東青島 266032)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由ASF 病毒(ASFV)引起的一種家豬和野豬急性、高度傳染性疾病[1]。ASFV 是目前已知唯一的DNA 蟲媒病毒，僅有一個血清型，但存在多種有毒力差別的病毒株。ASFV 的基因組為雙鏈DNA，大小170 kb～190 kb。目前尚無有效的ASF 疫苗，控制該病只能依賴于可靠的監測計劃、撲殺感染豬和其他控制措施。由于天然弱毒株的存在，一些感染條件可能導致降低死亡率，在這些情況下，可以采用檢測特異性抗體對該病進行診斷。盡管現在已經建立了熒光定量PCR方法檢測感染動物中的ASFV[2]，但ASFV 特異性抗體檢測仍然是診斷和控制該病的主要工具。ASFV抗體檢測技術已經成為亞急性、慢性或亞臨床感染動物診斷的公認方法[3]。目前具有診斷意義的病毒基因及其編碼蛋白主要有：B646L(P72 蛋白)、E183L(P54 蛋白)、CP204L(P30 蛋白)和CP530(PP62蛋白)等[3-5]。ASFV 的P30 蛋白由CP204L 基因編碼，是ASFV 的重要結構蛋白之一，為病毒的早期蛋白，在感染后4 h 胞漿內即可檢測到[6]，針對該蛋白已經建立了多種檢測技術如ELISA、免疫印跡檢測抗體[7]。

我國還未發現ASF，但該病一旦傳入將對我國養殖行業造成嚴重的損失，因此國內急需建立該病的快速檢測技術。本研究采用重組桿狀病毒表達ASF VP30 蛋白，并鑒定了其抗原性和在ELISA 中的反應原性，為ASFV 抗體ELISA 檢測方法的建立奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒核酸、細胞及血清 ASFV 格魯吉亞株CP204L 基因參照GenBank 中的序列(FR682468)由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；Sf9 細胞購自Life Technologies 公司；ASFV 標準陽性及陰性血清購置西班牙INGENASA 公司；豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)和豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清均由本實驗室制備和保存。

1.2 主要試劑 Phusion 超保真PCR 試劑盒、T4 DNA 連接酶、限制性內切酶和蛋白質Marker 購自NEB 公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN 公司；抗6×His 單克隆抗體(MAb)、HRP標記的兔抗鼠IgG(IgG-HRP)和羊抗豬IgG-HRP 及二氨基聯苯胺(DAB)購自Sigma 公司；His GraviTrap親和柱購自GE Healthcare 公司；Lipofectin 轉染試劑、Sf9 細胞培養基和NuPAGE 12 % Bis-Tris 預制膠購自Life Technologies 公司；PageRuler 預染色蛋白Marker 購自Thermo Scientific 公司；flashBAC 表達系統和pOET-1 質粒購自Oxford Expression Technology 公司。

1.3 引物的設計 根據GenBank 登錄的ASFV 基因組序列(FR682468)中的CP204L 基因設計上下游引物P30F/P30R：5'-GGATCCCCGCGGATGGATTTTATTT TAAATATATCC-3'(SacⅡ)/5'-ATCCTTAATTAATTA GTGATGGTGATGGTGATGTTTTTTTTAAAAGTTTA ATAACCATG-3'(PacⅠ)，同時在下游引物的末端加入組氨酸標簽，便于重組蛋白的純化。

1.4 重組轉移載體的構建 使用PCR 試劑盒和引物P30F/P30R 擴增P30 蛋白全長基因。將PCR 產物經SacⅡ/PacⅠ雙酶切克隆至pOET-1 載體中，構建重組質粒pOET-P30，重新進行擴大培養后，提取質粒以供轉染使用。

1.5 重組桿狀病毒的制備及鑒定 參照Lipofectin轉染試劑說明書步驟，將flash BAC DNA 和pOETP30 按照flash BAC 表達系統說明書制備P1 代重組病毒。將P1 代重組桿狀病毒液接種Sf9 細胞進行重組病毒的擴增與傳代，得到P2 和P3 代重組桿狀病毒。提取P3 代桿狀病毒DNA，以其為模板采用測序引物進行PCR 鑒定重組病毒DNA。

1.6 ASFV重組P30蛋白(rP30)的鑒定及純化 將P3 代重組桿狀病毒的上清液接種Sf9 細胞，27 ℃培養48 h，收集并裂解細胞后進行SDS-PAGE 電泳；采用半干法將電泳產物轉印至硝酸纖維素膜上，以2%的BSA 封閉2 h，分別以抗6×His MAb(0.2 μg/mL)和ASFV 陽性血清(1∶200)為一抗，兔抗鼠IgG-HRP或羊抗豬IgG-HRP(1∶10 000)為二抗，DAB 顯色，進行western blot 鑒定。并采用His GraviTrap 親和柱按照產品說明書進行rP30 的純化。

1.7 rP30的反應原性檢測 rP30 純化后，使用pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋成200 ng/mL 后包被ELISA板，50 μL/孔包被酶標板奇數條，pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液50 μL/孔直接包被酶標板偶數條，封閉后進行間接ELISA，其中對照血清及待檢血清以1∶40 倍稀釋，兔抗豬IgG-HRP 以1∶10 000 倍稀釋，最后計算OD450nm值差=OD 樣品奇數孔-OD 樣品偶數孔。采用該方法對CSFV 陽性血清、PRRSV 陽性血清、豬FMDV 陽性血清、PRV 陽性血清、ASFV 標準陽性血清和ASFV 標準陰性進行檢測。

2 結果與討論

2.1 目的基因的擴增及重組質粒的構建 將PCR擴增后的p30 基因克隆至pOET-1 載體中構建重組質粒pOET-P30，經SacⅡ/PacⅠ雙酶切、PCR 鑒定及測序鑒定顯示，目的片段大小約為600 bp，與預期結果相符(圖1)。

圖1 p30 基因的擴增Fig.1 PCR product of p30 gene

2.2 表達rP30的重組桿狀病毒制備 將重組質粒和flash BAC DNA 共轉染Sf9 細胞，同時設立轉移載體對照和細胞空白對照。72 h 后觀察細胞病變情況。與空白對照細胞相比，產生重組桿狀病毒的細胞中細胞數量明顯減少，生長緩慢甚至停滯，病變細胞個體膨脹，體積變大，胞內有顆粒物形成，個別細胞破裂、裂解。

2.3 rP30表達的鑒定 收集接種P3 代重組桿狀病毒72 h 后的細胞裂解產物和純化后的蛋白進行SDS-PAGE，結果表明，在分子量約30 ku 處出現特異性條帶，與預期相符，而正常細胞對照無此條帶(圖2A)。

圖2 rP30 表達的SDS-PAGE(A)分析及western blot 的His MAb(B)和陽性血清(C)鑒定Fig.2 SDS-PAGE analysis(A)and identifications of the expressed rP30 protein by His MAb(B)and positive serum(C)

使用抗His 標簽MAb 和ASF 陽性血清對重組蛋白western blot 檢測表明，只有感染重組桿狀病毒的細胞和純化后的重組蛋白出現特異性條帶，位置在約30 ku 處(圖2B 和2C)，表明Sf9 細胞中表達的P30 蛋白能夠被ASF 陽性血清識別。

2.4 rP30的反應性檢測 根據公式：臨界值=陰性樣品的平均OD 值+3×標準偏差(SD)，確定臨界值為0.2。以rP30 為包被抗原，采用間接ELISA 方法對CSFV、PRRSV、FMDV 和PRV 陽性血清進行檢測，結果顯示其臨界值均小于0.2，檢測結果為陰性，而與ASFV 標準陽性血清的反應結果呈陽性，與其它文獻報道一致[8]。使用E.coli 表達的rP30 蛋白即使經過純化，結果還是會帶有很高的背景反應[9-10]。因此，在ELISA 中以桿狀病毒表達的蛋白作為抗原可以減少假陽性，有利于更精確地診斷。

本研究中應用重組桿狀病毒表達了ASFV 的P30 蛋白，并驗證了其反應原性，為ASF 血清學檢測技術的建立奠定了基礎。

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