H5N1亞型禽流感病毒NP蛋白一個雞MHCⅠ分子限制性T細胞表位的鑒定

朱鳳珠，許傳田，魯 梅，張秀美，黃慶華，黃艷艷，楊少華，吳家強，譚劉剛，崔言順*

(1.山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 250100；3.山東濰坊工程職業學院，山東青州 262500)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是危害養禽業的主要病原之一，給養禽業帶來了嚴重的經濟損失。AIV 不但可以感染家禽，而且已逐漸具有感染哺乳動物(包括人)的能力，嚴重威脅到人類的生命安全[1-2]。目前中國的禽流感防制主要是采取捕殺并結合疫苗免疫的策略[3]。AIV 血清型眾多，基因組高度變異，需要根據病毒的變異情況不斷更換流感病毒疫苗株，頻率大，費事費力，但疫苗的研發速度還是跟不上病毒的變異速度。鑒于以上情況，有必要研發一種流感病毒的通用疫苗[4]。

AIV 的NP 蛋白在不同亞型流感病毒中高度保守[5-7]。NP 蛋白含有大量的細胞毒性淋巴細胞(CTL)識別的抗原表位，其誘導的細胞免疫反應可以抵御不同亞型流感病毒的感染[8-10]。許多關于流感病毒的T 細胞表位在人和小鼠中已獲得鑒定，研究表明利用含有H5N1 流感病毒NP 的T 細胞表位(NP147-155)的H5N1 HA 蛋白的表達重組質粒pHA/NP147-155免疫小鼠，能夠誘導NP 蛋白CD8+表位特異的T 細胞反應；H5N1 流感病毒攻毒試驗表明，免疫pHA/NP147-155的小鼠比只免疫pHA 的小鼠能夠顯著降低炎癥反應程度，而且肺臟中的病毒含量顯著降低[11-12]。

本研究通過生物結構學技術預測了H5N1 AIV流行株NP 的4 個潛在的T 細胞表位多肽，以表達NP 基因的重組質粒免疫SPF 雞，采集免疫雞脾淋巴細胞，分別利用4 個合成的候選肽刺激脾淋巴細胞，檢測脾淋巴細胞分泌IFN-γ 的含量，驗證候選肽的免疫原性。

1 材料和方法

1.1 病毒株及雞胚 H5N1 亞型AIV 分離株691 是國家流感中心參考實驗室由山東省東營市發病鴨群送檢病料分離鑒定；SPF 雞胚和SPF 雞購自山東省農科院家禽研究所SPF 雞研究中心。

1.2 引物、菌種、質粒、細胞及主要試劑 參考GenBank 中AIV 全基因組序列，設計用于擴增NP基因(1 565 bp)的特異性引物(5'-GGAATTCACC ATGGCGTCTCAGGGCACC-3'/5'-CCGCTCGAGTCAA TTGTCATATTCCTC-3')，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；E.coli DH5α 和限制性內切酶購自TaKaRa 公司；真核表達質粒pCAGGS 購自優寶生物；293T 細胞由本實驗室保存；TRIzol RNA 抽提試劑、One-Step RT-PCR 試劑盒和DNA Marker DL 2000 均購自山東賽恩斯科技有限公司；H5 亞型陽性血清(雞源)由哈爾濱獸醫研究所惠贈；FITC 標記的羊抗雞抗體(IgG-FITC)購自Abbkine 公司；HRP標記的羊抗雞抗體(IgG-HRP)購自KPL 公司；羧甲基熒光素乙酰乙酸(CFSE)均購自Sigma 公司；Lipofec-tamineTM3000 購自Invitrogen 公司；AIV 抗體ELISA 試劑盒購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；雞IFN-γ ELISA 試劑盒均購自KINGFISHER公司；雞臟器組織淋巴細胞分離液購自TBD 公司(LTS1090CP)。

1.3 短肽的預測及合成 利用同源模建技術，通過BLAST 針對PDB 數據庫進行搜索，尋找與目標序列相似的模板結構。選擇序列相似性和序列一致性均較高的幾個蛋白結構作為模板進行同源模建。之后采用分子動力學模擬技術，由NAMD 2.7 程序包，在CHARMM 力場下完成。最后完成蛋白對接，由ZDOCK 軟件包完成。合成短肽序列為：NP120-128(TRALVRTGM)、NP163-172(IRMIKRGIND)、NP85-92(IRRIWRQA)、NP67-74(RRRDGKWV)。

1.4 真核表達NP重組質粒的構建 將按照TRIzol試劑說明書方法提取AIV 分離株691 感染雞胚尿囊液中的總RNA，反轉錄制備cDNA，以其為模板，利用NP 基因引物進行PCR 擴增。PCR 程序為：95 ℃4 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃1.5 min，30個循環；72 ℃10 min?；厥债a物經Eco RⅠ/XhoⅠ雙酶切處理后克隆于pCAGGS 載體中，構建重組質粒pCAGGS-NP，并對其進行測序鑒定(H5N1 病毒操作在流感參考實驗室完成)。

1.5 間接免疫熒光(IFA)檢測NP蛋白的瞬時表達待293T 細胞長成70 %～90 %時轉染pCAGGS-NP。轉染48 h 后棄培養液，采用4 %多聚甲醛固定細胞單層15 min，加入0.2%TritonX-100 作用15 min，以稀釋后的H5 亞型陽性血清為一抗，稀釋后的羊抗雞IgG-FITC 為二抗，進行NP 蛋白的瞬時表達檢測。

1.6 NP表達的western blot檢測 收集pCAGGSNP 轉染48 h 后的293T 細胞，加入細胞裂解后，進行SDS-PAGE，并電轉至NC 膜，5%脫脂奶粉封閉，以H5 亞型陽性血清(1∶200)作為一抗，羊抗雞IgGHRP(1∶5 000)為二抗，通過DAB 顯色，進行NP 蛋白的瞬時表達的western blot 檢測。

1.7 間接ELISA方法建立和重組質粒免疫后抗體的檢測 原核表達的NP 蛋白以不同濃度包被ELISA 板，對H5 亞型陽性血清及陰性血清也以不同的稀釋倍數進行ELISA 試驗。利用方陣法，最終確定NP 蛋白的最佳包被濃度為：4.5 μg/mL，血清的最佳稀釋倍數為1∶100。結果判定標準為：OD450nm值<0.58 為陰性血清，P/N≥2.3 為陽性血清。

24 只3 周齡SPF 雞平均分成兩組：A 組接種pCAGGS-NP 進行免疫；B 組接種空載體作為對照。免疫劑量為100 μg/只；免疫途徑為腿部多點肌肉注射；免疫后21 d 以相同的劑量和方式加強免疫一次。所有實驗雞于免疫后7 d、14 d、21 d 采血，分離血清，利用建立的間接ELISA 檢測血清的NP 抗體。

1.8 合成短肽的鑒定 于pCAGGS-NP 加強免疫兩周后的SPF 雞，無菌取出脾臟，采用常規方法分散脾細胞，利用淋巴細胞分層液分離淋巴細胞，RPMI-1640 完全培養液調整細胞濃度為1×106個/mL，接種于24 孔板，每孔1 mL，分別加入4 種合成短肽和不相干短肽(傳染性支氣管炎表位肽SP6)，終濃度為100 μg/mL。同時設置正常的脾淋巴細胞為空白對照組。37 ℃5% CO2培養48 h 后取細胞上清，分別采用熒光定量PCR 及ELISA 試劑盒檢測IFN-γ 的分泌量。

1.8.1 熒光定量PCR 檢測IFN-γ 基因表達量 收集培養48 h 后的脾細胞，采用TRIzol 試劑提取脾細胞的總RNA。利用One-Step RT-PCR 試劑盒反轉錄制備cDNA。根據本實驗室已建立的IFN-γ 的標準曲線，以cDNA 為模板對樣品進行熒光定量PCR 檢測。以雞β-actin 基因作為內參基因。每種細胞中IFN-γ 基因mRNA 的拷貝數由熒光曲線的Ct 值和標準曲線計算獲得。IFN-γ 基因mRNA 表達水平為IFN-γ 基因總拷貝/β-actin 基因總拷貝。根據公式計算出每個樣本的歸一化值，歸一化值=目的基因濃度/內參基因濃度。利用公式：

計算待測組目的基因相對于對照組的表達差異倍數。分別統計待測組和對照組所有樣本歸一化值的平均數及標準差

1.8.2 IFN-γ 的ELISA 檢測 建立IFN-γ 的ELISA標準曲線，按照IFN-γ 的ELISA 試驗步驟進行操作，測定OD450nm值。利用ELISAcalc 軟件進行分析數據，通過“Logistic 曲線擬合2(四參數)”模型得到ELISA 標準曲線。將樣品和對照組的OD 值代入標準曲線即可得到IFN-γ 的濃度。

2 結果

2.1 目的基因的擴增及重組表達質粒的構建 以提取AIV 分離株691 的RNA 反轉錄制備的cDNA 為模板，采用PCR 擴增其NP 基因。結果顯示，擴增片段約為1 600 bp；測序結果(1 565 bp)與預期結果一致(圖1)。將擴增的NP 基因經XhoⅠ/Eco RⅠ處理后克隆于pCAGGS 中，構建真核重組表達質粒pCAGGS-NP。

圖1 AIV 的NP 基因的PCR 擴增Fig.1 Amplification of the AIV NP gene by PCR

2.2 IFA和western blot鑒定NP蛋白的瞬時表達重組質粒pCAGGS-NP 轉染293T 細胞48 h 后，在熒光顯微鏡下轉染空質粒的細胞未出現熒光信號(圖2A-1)，而轉染重組質粒的細胞出現較為強的綠色熒光(圖2A-2)。Western blot 鑒定結果顯示，轉染pCAGGS-NP 的293T 細胞樣品在60 ku 出現明顯一條帶，與預期大小一致，而空載體和未轉染的293T細胞樣品無任何條帶(圖2B)。該試驗結果表明：重組質粒pCAGGS-NP 在真核細胞中能夠得到正確的表達。

圖2 重組質粒pCAGGS-NP 的IFA(A)和western blot(B)鑒定Fig.2 Identification of pCAGGS-NP by IFA(A)and western blot(B)

2.3 免疫雞血清中的NP抗體 采用原核表達的NP 蛋白作為包被抗原的ELISA 方法，對pCAGGSNP 首免后不同時間點采集的血液樣品中的抗體進行檢測。結果顯示，首次免疫pCAGGS-NP 后，第一周雞血清NP 抗體幾乎檢測不到，第二周和第三周抗體滴度變化不明顯，第三周加強免疫后1 周，NP 抗體滴度快速升高30 %(圖3)。表明重組質粒pCAGGS-NP 在雞體內獲得了表達，并且誘導雞體產生體液免疫反應。

圖3 血清中NP 抗體的變化水平Fig.3 The change of the NP antibody level in immunized chickens

2.4 短肽的鑒定

2.4.1 不同短肽刺激脾淋巴細胞IFN-γ 基因表達量的檢測 分別經4 種短肽和不相關肽SP6 刺激后，NP67-74刺激脾淋巴細胞的IFN-γ 基因mRNA 拷貝數明顯高于對照組正常脾淋巴細胞(p≤0.05)，NP120-128、NP163-172、NP85-92和不相關短肽SP6 刺激的脾淋巴細胞產生的表達IFN-γ 基因的mRNA 拷貝數差異不顯著(p≥0.05)。除去試驗本身誤差，將拷貝數做歸一化處理后，NP67-74刺激的脾淋巴細胞產生的IFN-γ 歸一化值最高(圖4)，其IFN-γ 基因歸一化值明顯高于對照組(p≤0.05)，NP120-128、NP163-172、NP85-92和不相關短肽SP6 刺激的脾淋巴細胞產生的IFN-γ 基因歸一化值差異不顯著(p≥0.05)。3 次重復試驗結果表明，NP67-74能夠刺激雞脾淋巴細胞IFN-γ 分泌，引起機體細胞毒性T 淋巴細胞反應，為優勢肽。

2.4.2 不同短肽刺激后脾淋巴細胞分泌IFN-γ 的檢測結果 收集經短肽刺激48 h 后的來源于pCAGGSNP 免疫雞的脾臟淋巴細胞，按照IFN-γ ELISA 試劑盒操作說明書進行試驗，并由ELISAcalc 自帶軟件計算出4 種短肽和不相干短肽刺激脾淋巴細胞后生成的IFN-γ 的濃度以及正常脾淋巴細胞產生的IFN-γ 的濃度(圖5)。結果表明：短肽NP67-74能夠刺激雞脾淋巴細胞IFN-γ 分泌明顯增加，而短肽NP120-128、NP163-172、NP85-92和不相關肽及不加任何刺激物的正常雞脾淋巴細胞IFN-γ 分泌水平較低。

圖4 體外培養的免疫雞脾淋巴細胞經短肽刺激后IFN-γ mRNA 相對表達結果Fig.4 The relative IFN-γ mRNA expressions from the immunized chicken splenic lymphocytes stimulated by the peptides in vitro

圖5 ELISA 檢測脾不同多肽刺激后淋巴細分泌IFN-γ 的表達水平Fig.5 Detection of chicken IFN-γ section after stimulated with different short peptide by ELISA

3 討論

AIV 是危害養禽業的主要病原之一，禽類在抵抗該病毒感染的過程中細胞免疫起著重要的作用[13]。NP 作為病毒的內部結構蛋白，可以誘導CTL 免疫反應的發生，從而協助機體清除體內病毒，在不同亞型的AIV 之間具有一定的交叉保護力。

CTL 通過識別主要組織相容性復合物(MHC)I類分子結合的抗原表位來殺傷靶細胞。MHC-I 類分子可以識別具有特定motif 的8 肽或9 肽，在識別的過程中，溝槽底部的某些氨基酸與表位肽中的某些氨基酸相互作用，從而達到特異性識別的效果。

細胞免疫的重要組成部分為CTL 表位，而T 細胞表位具有MHC 限制性[14]。本研究中，使用的SPF雞是來航雞，而該雞種是B15 單倍型，即它只含有一種MHC-I 類分子，因此可以以表位肽與B15 MHC-I 類分子的相互作用結果來解釋實驗現象。這為利用分子建模和分子力學技術在NP 蛋白中篩選潛在表位肽提供了基礎。

CTL 表位與MHC I 類分子結合后被CD8+T 細胞識別，引起T 淋巴細胞增殖，并伴隨IFN-γ 分泌量的增加[15]。因此可以通過檢測細胞分泌IFN-γ 含量以及表達IFN-γ 的mRNA 的量來驗證的T 細胞表位是否正確。本研究利用蛋白結構技術預測了H5N1 AIV NP 蛋白的4 條CTL 表位肽，并且鑒定了1 條短肽NP67-74具有免疫學原性。

本實驗采用含有全長AIV NP 基因的重組質粒pCAGGS-NP 免疫SPF 雞，在血清中檢測到了NP 的特異性抗體，表明pCAGGS-NP 可以誘導機體體液免疫反應。NP67-74刺激的脾淋巴細胞分泌雞IFN-γ 最多，而且熒光定量PCR 證明NP67-74刺激的脾淋巴細胞生成的表達雞IFN-γ 的mRNA 的拷貝數最高。以上結果間接證明了CD8+T 細胞增殖增加，表明短肽NP67-74能夠誘導CTL 反應，可能是AIV NP 蛋白的CTL 表位。但由于實驗條件和資源的欠缺，本研究沒有通過流式細胞技術鑒定CD8+T 的增殖試驗，還需進一步鑒定。但這不影響本實驗對NP 蛋白CTL表位的鑒定結果。該研究結果對研究抗流感病毒的免疫機制和研究流感通用疫苗具有重要的意義。

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