鹿舍內氣載真菌濃度的檢測及其粒譜分析

孟 凱，馬藤菲，孫文靜，柴同杰，劉建柱，馬澤芳

(1.山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.青島農業大學動物科技學院，山東青島 266109)

真菌氣溶膠為真菌孢子和菌絲附著在固、液顆粒上懸浮在空氣中形成，具有很寬的粒譜范圍(1 μm～100 μm)[1]。畜舍環境可以不斷的產生真菌氣溶膠，并且借助空氣介質擴散和傳輸，不僅污染環境，還會對畜禽以及畜禽飼養人員的健康構成威脅。真菌進入呼吸道后，還能不斷的產生毒素，誘發一定的病變，引起感染、過敏、炎癥和中毒反應[2]。其中，芽枝霉(Cladosporium)、鏈格孢(Alternaria)、黑附球菌(Epicoccum nigrum)以及灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等真菌孢子被認為是環境真菌氣溶膠的主要構成(約90 %)，而青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)孢子則比例較小[3]。

研究證實，養殖業的大規模發展已成為自然環境真菌污染的重要來源，而且真菌氣溶膠在畜舍內會形成相對穩定的存在形式。雖然空氣中微生物種類繁多，但在不同的環境、氣象因素等條件下，空氣中真菌的種群結構和濃度也具有很大的變化，不同的養殖環境和人類活動均會對環境中真菌的種類和組成水平產生影響。

特種經濟動物養殖已成為我國畜牧業發展的重要方向之一，梅花鹿養殖業成為農業增收的重要途徑，相關的環境健康問題也尤為重要。但目前國內梅花鹿養殖環境的真菌氣溶膠的檢測尚屬空白。因此，本研究采集了山東5 個梅花鹿養殖舍的空氣樣本，對鹿舍養殖環境中真菌氣溶膠微生物多樣性及其粒徑分布進行了檢測，為闡明鹿舍養殖環境真菌的種群結構及其傳播機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 在山東德州、臨沂、泰安、濟寧、淄博的5 個半封閉圈養梅花鹿舍(a～e)分別設點進行采樣，每個養殖場采樣5 個，采樣高度距離地面50 cm，收集時間根據環境衛生狀況在2 min～4 min。采樣器選擇國際標準的Andersen-6 級(A-F)采樣器，空氣流量為28.3 L/min，培養基為虎紅氯霉素瓊脂平板。

1.2 采樣方法 無菌操作將平皿放入滅菌的Andersen 生物空氣采樣器中，將撞擊器置于距離地面50 cm 高度，打開撞擊器進氣口，離開采樣點2 m之外啟動采樣，設定采樣時間；采樣完畢取出采樣平皿，封好并標記，迅速帶回實驗室進行真菌的培養鑒定。

1.3 真菌的培養與鑒定 采集樣品置于25 ℃溫箱中培養72 h，計算各級采樣皿上真菌菌落數(cfu)，為避免遲發菌落產生的誤差，繼續培養至第7 d 進行一次校正計數，所得結果即為真菌氣溶膠粒子數。培養后的樣品置于立體顯微鏡下觀察，將形態不同的菌落進行計數和純培養。分離純化的真菌菌株，根據其生化特性，選擇特定培養基進行培養，根據其菌落形態及真菌子實體形態特征(載孢體和分生孢子)進行鑒定。

1.4 真菌氣溶膠濃度計算 以每m3空氣中菌落形成單位數表示，計算公式為：cfu/m3=[Andersen-6 級采樣器收集的菌落總數/28.3 L/m3×采樣時間(min)]×1 000。

1.5 真菌氣溶膠粒譜分析 采樣器每一級的菌落數除以6 級總的菌落數即為各級所占的百分比。各采樣點真菌氣溶膠粒譜的特征以計數中值直徑(CMD)代表。方法是將在采樣點測定結果的各級百分比從F 級至A 級逐級累加，得出各級的累計百分率，再以各級累計百分率為橫坐標和給定的各級有效截留粒子徑(ECD)為縱坐標求出直線回歸方程，在x 為50 時的y 值即為CMD 值。真菌粒徑分布的離散度以幾何標準差(GSD)表示，即以直線回歸方程中x 為84.13 時的y 值除以CMD 值[4]。

2 結果

2.1 真菌氣溶膠濃度的各級分布 利用國際標準的Andersen-6 級空氣微生物采樣器對山東省5 處鹿舍內進行氣載真菌的檢測。調查結果顯示，所采集的5 個鹿舍真菌粒譜分布高峰均在D 級(2.1 μm～3.3 μm)，其次為C 級，而F 級真菌濃度最小(表1)。5 個鹿舍氣載真菌濃度統計結果顯示，最小值為0.69×103cfu/m3(鹿舍b)，最大值則為2.32×103cfu/m3(鹿舍d)(表2)，所以5 個鹿舍氣載真菌的濃度范圍在0.69 cfu/m3～2.32×103cfu/m3。

2.2 真菌氣溶膠濃度與環境因素的關系 對真菌氣溶膠濃度與鹿舍環境進行分析表明，在調查的5個半封閉圈養的鹿舍中，飼養密度最大的鹿舍真菌濃度最高，達到1.61×103cfu/m3；而且在其他因素基本一致的情況下，濕度對環境真菌氣溶膠濃度也具有一定的影響，濕度越大真菌濃度越高，而溫度對于真菌濃度的影響則不明顯(表3)。

表1 鹿舍不同粒徑的真菌濃度Table 1 The concentration of fungal particles in sampling environment

表2 鹿舍氣載真菌濃度Table 2 The concentration of airborne fungi

表3 鹿舍的環境因素與真菌氣溶膠的濃度及粒譜特征Table 3 Environmental index,concentration of fungi and the fungal particles of the sampling deer houses

2.3 真菌氣溶膠微生物多樣性 在調查的5 個鹿舍中，共采集15 個樣品(90 個平皿)，對其檢測到的活性真菌進行分析，結果顯示活性真菌菌落共588 個，按屬級標準分離純化共鑒定出14 個屬，其中優勢種群為鏈格孢屬(18.5 %)、青霉屬(18.0 %)、枝孢霉屬(9.4 %)、鏈孢菌屬(7.1 %)、木霉屬(6.6 %)、酵母菌屬(5.8 %)、擬青霉屬(5.4 %)、曲霉屬(5.1 %)，而彎孢霉屬、根霉屬、蠕孢屬、葡萄孢屬、紅酵母屬、帚霉屬所占比例則較小(表4)。對不同鹿舍真菌cfu值分析表明，飼養密度大、濕度大的鹿舍真菌cfu值也較高。

3 討論

養殖環境的清潔度，往往與動物疫病具有直接且緊密的聯系?？諝庾鳛樾笄萆瞽h境的重要媒介，氣溶膠同樣扮演著非常重要的角色，多種疫病病原可以借助氣溶膠在畜禽種群之間進行傳播，不僅危害畜禽生產，同樣對人的健康也構成威脅。有研究證實，以雛火雞為實驗對象，每克肺培養出2.2×106cfu 真菌的火雞，5 d 內即全部死亡，低于該數值者，發病延遲，死亡率降低[4]。而吸入肺的真菌濃度與環境真菌濃度存在一定的相關關系，即畜禽生活環境的真菌濃度可以為真菌病的發生提供預警資料。

表4 鹿舍真菌氣溶膠的優勢種群及其分布Table 4 Distribution of the dominant fungi in the sampling deer houses

畜禽環境真菌氣溶膠的濃度受到諸多因素的影響，如氣候、光照、衛生條件、動物生活習性、動物舍結構等[5]，本研究主要就可人為控制的動物飼養密度、溫度、濕度幾方面進行分析。研究表明，在其他因素相近的前提下，飼養密度越大，濕度越大，真菌氣溶膠的密度也隨之增大，與其他相關報道一致[6]。這也從另一側面表明，通過人為地降低飼養密度，適宜的降低濕度，加強鹿舍的通風可以改善養殖環境的真菌氣溶膠濃度，降低感染真菌病的風險。

不同粒徑的氣溶膠粒子進入和沉積畜禽以及人的呼吸系統的位置存在差異。粒徑為20 μm～30 μm的可以進入鼻腔和上呼吸道并沉積在支氣管，粒徑在6 μm～10 μm 的可沉積在小支氣管，而粒徑在1 μm～5 μm 的氣溶膠粒子則可進入肺的深部[7]。本研究中所采用的Andersen 采樣器收集的真菌氣溶膠粒徑范圍為0.3 μm～15 μm，該范圍粒子對人和畜禽危害較大，尤其是粒徑低于5 μm 的粒子，沉積率高達90 %。本研究在5 個鹿舍采集的樣本CMD值為3.3 μm～3.4 μm，均比一般的細菌粒徑小，原因可能是真菌粒子以單個孢子氣溶膠的形式飄散在空氣中；GSD 值均為1.7，表明粒徑分布的離散度較大，預示真菌粒子很容易進入呼吸道深部，危害也更大[8]。

在本次調查中，共分離鑒定出真菌類別達14 個種屬，表明鹿舍真菌氣溶膠具有復雜的微生物多樣性。在這些鑒定的真菌種類中，鏈格孢屬、青霉屬、枝孢霉屬、鏈孢菌屬等為優勢真菌屬，它們與真菌感染和真菌毒素中毒密切相關。比例最大的鏈格孢屬，可引起皮膚鏈格孢病、過敏性肺炎和哮喘等，其產生的鏈格孢毒素可能與食管癌有關；青霉屬也可誘發青霉菌病，引起腦和肺部病變，產生的毒素可導致人和動物的真菌性中毒；此外，枝孢霉屬部分種類可引起皮膚著色霉菌病以及系統性暗色絲孢霉病，曲霉屬的某些種群可導致人和動物的曲霉菌病等[9-10]。不同真菌種群致病力存在一定差異，而這些種類的真菌氣溶膠對于人和畜禽的危害尚需要進一步更為深入的研究。

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