牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護性抗原的篩選

馬建偉，吉佳樂，劉亞靜，李春明，馮思源，李能章，彭遠義

(西南大學動物科技學院重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 400715)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)為一種革蘭陰性菌，可以引起多種動物疾病，如禽霍亂、豬萎縮性鼻炎以及牛出血性敗血癥等[1-2]。Pm具有多種血清型，其中牛源A 型Pm 主要引起牛肺炎，B 型Pm 主要引起牛出血性敗血癥[3-4]，給養牛業造成了嚴重的經濟損失。

目前用于預防牛源Pm 疾病的疫苗只有針對B型Pm 的傳統疫苗，這類疫苗對不同血清型交叉保護弱[3]。開展交叉保護性抗原的篩選，對新型疫苗的研究具有重要意義。研究表明，在多株Pm 血清型中ompA、ompH、plpE[5]、pm0979、P6 以及pfhB 6 種基因編碼的蛋白能夠誘導較高的抗體水平，提供較好的保護性[6]，但這些蛋白中哪些能夠提供交叉保護性作用還未見報道。本研究以這6 種重組蛋白作為研究對象，對其交叉保護性進行研究，篩選并鑒定對A 和B 型Pm 均具有交叉保護性的抗原。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清及實驗動物 牛源A 型Pm CQ2株、B 型Pm CVCC450 株、大腸桿菌(E.coli)感受態DH5α、BL21 及Rosetta 株均由本實驗室保存；A 型和B 型Pm 陽性牛血清由本實驗室制備保存；18 g～25 g 清潔級昆明小鼠購自重慶中藥研究所。

1.2 主要試劑 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；核酸及蛋白質標準分子量Marker 購自Fermentas 公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自Omega公司；弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑購自Sigma公司；堿性磷酸酶(AP)標記的兔抗牛IgG(IgG-AP)購自鼎國生物技術有限公司；BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒購自Beyotime 公司。

1.3 引物設計與合成 根據本實驗室Pm CQ2 株相關基因測定序列，設計6 組特異性引物(表1)，由上海Invitrogen 公司合成。因本實驗室Pm CQ2 株基因組的plpE 基因為截短表達設計，因此設計了兩對引物對plpE 基因進行拼接擴增。

1.4 目的基因擴增及重組表達質粒的構建 以Pm CQ2 株基因組DNA 為模板，分別擴增pm0979、P6、pfhB、ompH、ompA 以及plpE 基因?；厥障鄳獢U增產物，將其克隆于pET-30a 或pET-32a 載體中，分別構建重組表達質粒，并由上海Invitrogen 公司測序鑒定。

表1 目的基因擴增引物Table 1 The primer of target gene

1.5 重組蛋白的純化及鑒定 分別將構建的重組質 粒 pET-plpE、pET-pm0979、pET-ompH、pETompA 和pET-P6 轉化至BL21(DE3)感受態細胞，以終濃度為1 mmol/L 的IPTG 37 ℃誘導4 h；將重組質粒pET-pfhB 轉化至Rosetta 感受態細胞，以終濃度為1 mmol/L 的IPTG 30 ℃過夜誘導表達。將表達的重組蛋白經Ni-NTA superflow cartridge His 親和層析柱純化，并將純化后的重組蛋白依次采用6 M 尿素、4 M 尿素、2 M 尿素、1 M 尿素、PBS 透析復性。

分別以A 型和B 型Pm 陽性牛血清作為一抗(1:8)，以抗牛IgG-AP 為二抗(1:15 000)，以BCIP/NBT 顯色，對重組蛋白進行western blot 鑒定。

1.6 小鼠攻毒保護性試驗 將140 只雌性小鼠隨機分為14 組，每組10 只，以復性的純化重組蛋白分別與等量的弗氏佐劑乳化，100 μg/只皮下免疫小鼠，首免7 d 后進行二次免疫，每種重組蛋白免疫2 組小鼠，同時設未免疫的對照組。采集二免21 d 后小鼠尾靜脈血并分離血清，參考文獻[7]的方法，利用間接ELISA 方法測定二免后小鼠體內血清抗體的產生情況。并于二免21 d 后采用劑量為2 LD50的Pm CQ2 株(4.4×105cfu)、Pm CVCC450 株(2.96×104cfu)腹腔接種攻毒。

2 結果

2.1 目的基因擴增及重組質粒的鑒定 以Pm CQ2株基因組為模板，采用PCR 分別擴增pm0979、P6、pfhB、ompH、ompA 及PlpE 基因。結果顯示各目的片段分別約為400 bp、450 bp、600 bp、1 050 bp、1 000 bp 及950 bp，與預期大小相符(圖1)。將純化的PCR 產物克隆于pET-30a 或pET-32a 載體中，分別構建重組表達質粒，測序結果顯示，重組表達質粒均構建正確。

圖1 目的基因的PCR 擴增結果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 重組蛋白的純化及鑒定

2.2.1 重組蛋白的純化 將構建的重組質粒分別轉化至BL21 或Rosetta 感受態細胞。重組菌株經IPTG誘導表達后，純化并進行SDS-PAGE 檢測。結果顯示，重組蛋白rPfhB(27 ku)、rOmpA(43 ku)、rOmpH(44 ku)、rPlpE(43 ku)、rP6(34 ku)以及rPm0979(21 ku)的分子量大小與預期相符(圖2)，表明各基因均正確表達了相關重組蛋白。

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE 檢測Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins

2.2.2 重組蛋白的免疫活性鑒定 對獲得的重組蛋白的表達形式進行鑒定，結果顯示各重組蛋白均以包涵體形式表達，分別對其復性后進行western blot鑒定。結果顯示，當以A 型Pm 陽性牛血清為一抗時，重組蛋白均能夠與陽性牛血清發生反應，出現了明顯的免疫特異性條帶，表明重組蛋白均具有良好的反應原性(圖3)。

2.3 免疫小鼠血清中抗體的產生情況 分別以復性后的重組蛋白rOmpH、rOmpA、rP6、rPm0979、rPlpE 以及rPfhB 免疫小鼠后，采用間接ELISA 試驗檢測二免后小鼠血清中抗體產生情況。結果顯示，重組蛋白rOmpH、rPm0979 及rPlpE 抗體水平均處于較高水平，而對照組抗體始終維持較低水平(圖4)，結果提示重組蛋白rOmpH、rPm0979 及rPlpE 可能會提供較好的保護性。

圖3 重組蛋白western blot 鑒定結果Fig.3 Western blot analysis of recombinant proteins

圖4 免疫小鼠血清抗體水平Fig.4 The assay of serum antibody in mice

2.4 小鼠攻毒保護性試驗結果 各組實驗小鼠于二免后21 d 以Pm CQ2 株(2 LD50)和Pm CVCC450 株(2 LD50)進行腹腔攻毒，各重組蛋白對小鼠的保護率結果見表2，結果表明重組蛋白rOmpH、rPm-0979、rP6 以及rPlpE 均具有交叉保護性作用，其中rPlpE的交叉保護性作用最強，對Pm CQ2 株的保護性達70 %，對Pm CVCC450 株的交叉保護性達40 %。

3 討論

近年來，Pm 亞單位疫苗的開發主要集中在菌體表面抗原成分，Pm 表面抗原成分包括LPS、莢膜、外膜蛋白及絲狀血凝素等，均與毒力機制密切相關[8]。目前，研究較多的Pm 外膜蛋白主要有OmpA、OmpH 等。OmpH 為Pm 菌體最主要的外膜蛋白，被認為是交叉保護應答中最主要的抗原[9]，可以誘導產生高水平的保護性抗體[10]；重組的OmpA蛋白能夠誘導免疫反應，并產生較高的IgG 抗體[11]。同時，在疫苗開發中脂蛋白被認為是潛在的靶抗原，截至目前，只有少數Pm 脂蛋白被驗證具有較好的免疫原性，如PlpE 和Pm0979，兩者均可以作為巴氏桿菌亞單位疫苗候選抗原[12]，PlpE 重組蛋白能夠對同源以及異源的Pm 產生不同程度的保護作用[13]；P6 樣外膜蛋白基因非常保守，而且Kasten等研究表明P6 樣外膜蛋白編碼的蛋白具有反應原性[14]；另外，Pm 的突變株pfhB 的毒力已被證明被完全減弱[15]。因此，本研究選取以上表面抗原基因進行原核表達，并對其免疫保護特性進行研究。

表2 重組蛋白免疫小鼠對Pm CQ2、Pm CVCC450 株的保護率Table 2 Protection efficacy of recombinant proteins to mice against the challenge of bovine Pm CQ2 strain and Pm CVCC450 strain

本研究對牛源Pm CQ2 株ompA、ompH、plpE、pm0979、P6 以及pfhB 基因原核表達后，通過western blot 鑒定以及小鼠攻毒保護性試驗，顯示6 種抗原對A 和B 型Pm 提供了不同程度的保護性，其中重組蛋白rPlpE 表現出較高的交叉保護性作用，對A 型Pm 提供了高達70 %的保護率，同時，對B 型提供了40 %的保護率。本研究中重組蛋白rPfhB 對A 型Pm 的保護性比預期的低，其原因可能是由于本研究中pfhB 基因不是全長基因，但具體機制還需進一步研究。

目前，對于牛源Pm 交叉保護性因子研究較少，本研究中篩選的3 種交叉保護性因子ompH、plpE以及pm0979 能夠在不同血清型的菌株之間產生較好的交叉保護性，可以作為后續開發融合蛋白疫苗的候選成分，為針對多種血清型Pm 的新型疫苗研發奠定了基礎。

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