貓杯狀病毒的分離鑒定及超變區基因序列分析

劉春國，劉永相，劉大飛，郭東春，田 進，仇 錚，劉 鑫，蔣艷妹，劉家森，彭永剛，李 巖，劉 明，曲連東*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農業大學動物醫學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.黑龍江省青岡縣畜牧獸醫局，黑龍江綏化 151600)

貓杯狀病毒(Feline calicivirus，FCV)隸屬于杯狀病毒科、水皰疹病毒屬[1]，主要引起貓傳染性鼻-結膜炎。該病發病率高，死亡率低，但有些病毒株能夠導致30 %的死亡率。自1957 年首次分離到FCV 以來，人們從世界各地的家貓[2]、老虎和獵豹[3]等野生貓科動物中分離到該病毒，表明該病毒能夠感染多種貓科動物，并且呈世界性分布。研究表明，從犬中也分離到FCV[4]，暗示該病毒具有跨種傳播的潛力和風險。疫苗接種是控制FCV 的有效手段，但不能預防其再次感染。FCV 的基因組包含一個正義單股RNA[2]，易于產生遺傳和抗原變異，這也是導致病毒毒力差異和疫苗免疫失敗的主要原因[5]。因此，了解FCV 的分子遺傳特征和生物學特性對于該病的防控至關重要。因此，對我國FCV 分離株進行分子遺傳學調查具有重要意義。本研究從患有嚴重結膜炎的病貓中分離到一株FCV，并對其進行了分子遺傳學鑒定分析，為了解FCV 在國內的變異情況提供了基礎數據。

1 材料和方法

1.1 病料樣品來源 2014 年5 月，黑龍江省某寵物醫院收治一只3 月齡雄性流浪暹羅貓，該貓患有嚴重的結膜炎，雙眼失明，并伴有輕微的卡他性鼻炎，初步診斷為FCV 感染。采集病貓的眼、鼻和口腔拭子，置于病毒凍存液中，-20 ℃保存備用。

1.2 主要試劑 FCV 2280 病毒購自ATCC；CRFK細胞由本實驗室保存；Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、PrimeScript 反轉錄酶、DL2000 DNA Marker、6mer 隨機引物和pMD18-T 載體購自寶生物工程(大連)有限公司；AxyPrep 體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒、膠回收試劑盒和質粒小量抽提試劑盒購自康寧生命科學(吳江)有限公司；FCV 貓陽性血清購自VMRD 公司；FITC 標記的山羊抗貓IgG(IgG-FITC)購自Jackson ImmunoResearch LABORATORIES，INC。

1.3 FCV的分離 將采集的拭子漩渦震蕩，離心后收集上清，經0.22 μm 濾膜過濾后接種CRFK 細胞單層，進行病毒分離。收集出現細胞病變(CPE)的細胞培養液進行病毒傳代，并通過蝕斑技術進行病毒純化。

1.4 FCV的間接免疫熒光(IFA)鑒定 當接種樣品濾液的CRFK 細胞單層出現30 % CPE 時，參照文獻[6]的方法進行IFA 鑒定。其中，以FCV 貓陽性血清為一抗，山羊抗貓IgG-FITC(1∶2 000)為二抗，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5 FCV的PCR鑒定及遺傳分析 提取病毒感染細胞的總RNA。以6mer 隨機引物進行反轉錄，制備cDNA。根據文獻[7]的報道合成FCV 的VP1 超變區序列鑒定引物進行PCR 擴增，將PCR 產物純化后克隆于pMD18-T 載體中進行測序。將測序結果與FCV 參考株基因序列利用DNAStar 程序中的MegAlign 軟件進行同源性比對；并以MEGA5.0 軟件中的鄰接法構建其系統發育樹。

2 結果與討論

2.1 CPE的觀察 將采集的病料樣品無菌處理后接種CRFK 細胞，20 h 后即產生明顯的CPE，細胞圓縮、聚團、折光性增強，直至全部脫落。病料樣品接種CRFK 細胞后能夠形成蝕斑，與參考株FCV 2280 相比，其形成的蝕斑較大(數據未顯示)。

2.2 病毒分離株的PCR及IFA鑒定 接種樣品濾液的CRFK 細胞單層出現CPE 后，提取細胞培養上清中的RNA，制備cDNA，并以其為模板，PCR 擴增FCV 的VP1 超變區序列，產物經凝膠電泳檢測后顯示在671 bp 處出現特異性片段，與預期結果相符(圖1A)。將病毒分離株感染并出現CPE 的CRFK細胞以FCV 陽性血清為一抗，進行IFA 鑒定，結果表明，病毒分離株和參考株FCV 2280 接種的細胞均出現明亮的綠色熒光，而未接種正常細胞未見綠色熒光(圖1)。PCR 和IFA 鑒定結果表明分離到的病毒株為FCV，命名為HRB-SS。

圖1 病毒分離株的PCR(A)和IFA(B)鑒定Fig.1 Identification of the virus isolate by PCR(A)and IFA(B)

2.3 FCV超變區的序列分析 將PCR 擴增的FCV VP1 超變區基因片段進行克隆測序，測序結果與FCV 參考株基因序列進行同源性比對，結果表明，HRB-SS 分離株與參考株之間的同源性在67.9 %～78.2%，與疫苗株CVXPOLYCAP 同源性最高(78.2%)，而與中國株CH-JL 和日本株Gon/2003/JP 的同源性最低(67.9 %)，與中國株GD 和日本株ym3/2001/JP的同源性也較低(68.8 %)。推導的氨基酸序列分析結果表明，分離株HRB-SS 與參考株之間的同源性在71.7 %～86.7 %，其中與韓國株12Q087-5，美國株UTCVM-NH12 和日本株FCLF4 的同源性最高(86.7%)，與日本株ym3/2001/JP 同源關系最低(71.7%)，而與中國株GD 和CH-JL 的同源性也比較低(73.9%)。

2.4 FCV超變區基因序列的系統發育樹構建 將FCV HRB-SS 分離株與參考株的超變區基因序列以MEGA5.0 軟件中的鄰接法構建系統發育樹(圖2)。結果表明HRB-SS 與CVXPOLYCAP 和UTCVMNH12 親緣關系最近，與韓國株12Q087-1 和12Q087-5位于同一進化分支內，而與中國株GD 和CH-JL 以及日本株Gon/2003/JP 和ym3/2001/JP 親緣關系較遠。

圖2 FCV HRB-SS 分離株超變區基因片段的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on hypervariable region gene of FCV HRB-SS

本研究從患有嚴重結膜炎的幼年流浪貓中分離得到一株FCV HRB-SS，該病毒與FCV 2280 參考株在蝕斑形態上具有顯著差異，表明HRB-SS 分離株可能具有獨特的生物學特性，有待于深入研究。HRB-SS 分離株與中國株CH-JL 和GD 的核苷酸同源性分別為67.9 %和68.8 %，差異在30 %以上，表明HRB-SS 與中國株之間差異非常大。系統發育樹分析結果進一步證實HRB-SS 與中國株GD 和CH-JL 親緣關系較遠，表明HRB-SS 與我國現存的FCV 起源于不同的進化祖先，表明我國FCV 在遺傳上具有生態多樣性。因此，對我國FCV 進行分子遺傳學調查對于揭示其遺傳變異規律具有重要意義。

[1]Prikhodko V G,Sandoval-Jaime C,Abente J,et al.Genetic characterization of feline calicivirus strains associated with varying disease manifestations during an outbreak season in Missouri(1995-1996)[J].Virus Genes,2014,48(1):96-110.

[2]Liu Chun-guo,Liu Yong-xing,Liu Da-fei,et al.Complete genome sequence of feline calicivirus strain HRB-SS from a cat in Heilongjiang Province,Northeastern China[J].Genome Announc,2014,2(5):e00698-14.

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[4]Di Martino B,Di Rocco C,Ceci C,et al.Characterization of a strain of feline calicivirus isolated from a dog faecal sample[J].Vet Microbiol,2009,139(1-2):52-57.

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[7]Sykes J E,Studdert V P,Browning G F.Detection and strain differentiation of feline calicivirus in conjunctival swabs by RT-PCR of the hypervariableregion of the capsid protein gene[J].Arch Virol,1998,143(7):1321-1334.