兩株野鳥源H9N2亞型禽流感病毒的進化分析和對小鼠的感染性研究

肖 麗，崔鵬飛，張 芳，關立崢，施建忠，鄧國華，陳化蘭

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/農業部動物流感重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A 型禽流感病毒(AIV)引起的禽類感染疾病綜合癥。AIV 的天然宿主為野鳥及水生鳥類，在家禽中，火雞、雞、鴨等也能夠分離到AIV[1]。AIV 按照對雞致病力高低分為高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)，而H9N2 亞型AIV 屬于LPAIV。一般情況下H9N2在野鳥中呈現隱性感染過程，不表現明顯臨床癥狀，因此感染LPAIV 的野鳥可以長期攜帶病毒，并隨其每年的遷徙而在不同國家間傳播。Andrew 等也發現H9N2 能夠通過野鳥在東亞和北美地區間傳播[2]。

自1998 年以來，頻繁有H9N2 亞型AIV 感染人類的報道[3]。在1997 年，香港暴發大量人感染H5N1 病例，經研究發現，分離到的H5N1 病毒與H9N2 的內部基因相似性在98 %～99 %，提示該H5N1 亞型AIV 與H9N2 亞型AIV 關系密切[4]。此外，2013 年人感染H7N9 和H10N8 病毒的內部基因與H9N2 亞型AIV 的內部基因高度同源。Matrosovich等發現，從香港活禽市場分離到的H9N2 亞型AIV具有α-2,6 受體結合特性，進一步證明其有感染人的能力[5]。禽源H9N2 AIV 與人源H3N2 AIV 在豬體內共存，為其基因重組提供了機會[6]。因此，對H9N2 亞型AIV 進行流行病學監測，了解其生物學特性具有重要的公共衛生意義。本研究室在2015 年從野鳥糞便中分離到兩株H9N2 AIV，分別命名為Wild Bird/SC/S1264/2015(H9N2)和 Wild Bird/SC/S1411/2015(H9N2)，簡稱(WB/SC/264/15)和(WB/SC/411/15)。為了解這兩分離株的遺傳背景、與家禽H9N2 AIV 的相關性以及病毒對哺乳動物的感染性，本研究對這兩株H9N2 AIV 進行了全基因組序列分析和小鼠感染性試驗，為了解該亞型AIV 在國內的流行及其生物學特征提供了基礎數據。

1 材料和方法

1.1 病毒及實驗動物 兩株H9N2 亞型AIV WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 由國家參考實驗室分離并鑒定；SPF 雞胚購自本研究所實驗動物中心；BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 TRIzol 試劑和反轉錄酶(MLV)購自Invitrogen 公司；Taq DNA 聚合酶及DL2000 DNA Marker 等均購自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 購自Omega 公司；DNA 測序試劑盒購自Applied Biosystem 公司。

1.3 引物及參考序列 根據GenBank 中登錄的各亞型基因節段序列選擇同源性最高的區域設計引物；反轉錄通用引物序列：5'-AGCAAAAGCAG G-3'；所有擴增及測序引物均由國家禽流感參考實驗室設計并保存。

1.4 病毒的增殖及雞胚半數感染量(EID50)測定 將10 倍倍比稀釋后的病毒接種9 日齡～11 日齡SPF雞胚，純化3 代后進行病毒增殖及保存；增殖后的H9N2 AIV 按10 倍倍比稀釋，每個稀釋度接種4 個9 日齡～11 日齡SPF 雞胚，于37 ℃孵育48 h 后收集感染雞胚尿囊液并測血凝價，根據Reed-Muench法計算病毒的EID50。

1.5 全基因組序列測定與分析 采用TRIzol 試劑提取病毒RNA，反轉錄制備cDNA 后，進行8 個基因片段的PCR 擴增，PCR 產物按照小量膠回收試劑盒的說明書的方法進行純化，然后測序。所有序列通過MegAlian 軟件、Mega 5 軟件等進行分析。

1.6 BALB/c小鼠感染性試驗 將病毒稀釋至106EID50/0.05 mL，待小鼠輕微麻醉后，鼻腔接種0.05 mL的病毒稀釋液。WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 分別接種8 只6 周齡的BALB/c 雌性小鼠，同時以等量的PBS 接種5 只小鼠作為陰性對照組。接種后3 d，每個感染組隨機迫殺3 只小鼠，采集腦、鼻甲、脾、肺和腎臟進行病毒滴定。其余小鼠連續觀察14 d，并記錄每天的小鼠體重變化情況。

2 結果

2.1 序列進化分析 以提取的兩個病毒分離株RNA 經反轉錄制備的cDNA 為模板，PCR 擴增其8個基因片段，然后測序。將WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 的全基因組序列在NCBI 上進行BLAST比對結果顯示，各基因片段分別與H9N2、H7N9、H9N6、H6N2、H5N1 等多種亞型的AIV 高度同源(表1)。

2.1.1 HA 基因序列及進化分析 WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 的HA 基因的編碼區均為1 683 nt，編碼560 個氨基酸殘基。氨基酸序列分析結果顯示，兩個分離株編碼的HA 裂解位點基序均為333PSRSSR↓GL340，符合LPAIV 特征。而且，其HA蛋白受體結合位點處的第226 位及228 位分別為谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，具有結合禽源AIV 受體的分子特征。WB/SC/264/15 的HA 具有7 個潛在糖基化位點，分別為29NST31、141NVS143、298NTT300、305NVS307、313NCS315、492NGT494及551NGS553。由于WB/SC/411/15 的HA 蛋白中第220 位氨基酸殘基為異亮氨酸(I)，導致其HA 蛋白比WB/SC/264/15 多一個糖基化位點，即218NRT220。兩個分離株的HA 基因同屬于Beijing/1/94-like 分支，核苷酸同源性為94.3 %(圖1)。

表1 兩個分離株全基因組序列Blast 分析結果Table 1 The blast analysis of genes of WB/SC/264/15 and WB/SC/411/15

圖1 HA 基因進化樹Fig.1 Phyogenetic tree based on HA gene

2.1.2 NA 基因序列及進化分析 WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 的NA 基因編碼區長度均為1 401 nt，無頸部缺失，共編碼466 個氨基酸，核苷酸同源性為98.1 %。均具有7 個潛在糖基化位點，分別為66NST68、83NWS85、143NST145、197NAT199、231NGT233、261NGT233、261NIS263和365NGS367。WB/SC/264/15 與A/pheasant/Hong Kong/NT279W/2009(H9N2)的NA 基因核苷酸同源性在97 %。而WB/SC/411/15 與A/Anser fabalis/China/HuBS428/2014(H9N2)的NA 基因核苷酸同源性在98 %。

2.1.3 內部基因序列及進化分析 內部基因序列分析顯示，WB/SC/264/15 與A/tree sparrow/Shanghai/01/2013(H7N9)的M 基因核苷酸同源性高達99 %。而WB/SC/411/15 與一株人源H5N1 亞型AIV(A/Human/zhejiang/16/2006)的M 基因核苷酸同源性在95%。兩個分離株的NS 蛋白頸部均未出現缺失。兩個分離株的M、NP、NS、PA、PB1 和PB2 的核苷酸同源性分別為93.9 %、97.7 %、95.3 %、97.2 %、98.3 %和95.5 %。SC/264/15 和SC/411/15 的內部基因與H9N2、H7N9、H9N6、H6N2、H10N8、H10N6 和H5N1 等多種亞型的AIV 核苷酸同源性較高，表明內部基因來源復雜。

2.2 兩個分離株對BALB/C小鼠的感染性試驗 以106EID50的病毒量接種小鼠后，小鼠未出現明顯的臨床癥狀。在接種病毒后小鼠體重出現輕微下降，之后上升(圖2)。在鼻腔接種病毒后的第3 d 每組隨機迫殺3 只小鼠，采集臟器進行病毒滴定。臟器滴定結果顯示，只在上呼吸道鼻甲中分離到病毒，而其他臟器滴定結果均呈陰性(圖3)。

圖2 小鼠感染病毒后體重變化情況Fig.2 Weight change of mice after inoculated with virus

3 討論

圖3 接種3 d 后BALB/c 小鼠臟器滴定結果Fig.3 Virus titer in BALB/c mouse organs on days 3 post inoculation

為了解H9N2 亞型AIV 的遺傳進化特征以及對哺乳動物的潛在危害性，本研究對從野鳥糞便中分離到的兩株H9N2 亞型AIV 進行全基因組序列和BALB/c 小鼠的感染性試驗。小鼠感染性試驗結果顯示，兩個分離株對小鼠呈低致病性特征，體重無明顯變化，也未見明顯的臨床癥狀，臟器滴定結果顯示病毒僅在小鼠上呼吸道鼻甲內有效復制，而近期張芳等分離的一株野鳥源的H9N2 亞型AIV 卻不能在小鼠的任何臟器內復制[7]，表明野鳥源的H9N2亞型AIV 對小鼠的感染性也存在差異。另外，兩個分離株的HA 蛋白第226 位及228 位分別為谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，傾向于結合禽源AIV 受體，也表明其感染哺乳動物的能力弱。目前國內H9N2 亞型AIV 的HA 蛋白的第226 位大多數為傾向結合人源受體的賴氨酸(L)，表明兩個分離株來源可能比較原始。對兩株H9N2 亞型AIV 進行遺傳進化分析顯示，各基因片段與H6N2、H7N9、H9N6、H9N2、H5N1 等多種亞型AIV 的核苷酸同源性均較高，表明不同亞型AIV 的內部基因重組現象明顯。值得注意的是，WB/SC/411/15 與一株人源H5N1 亞型AIV(A/Human/zhejiang/16/2006)的M 基因核苷酸同源性在95 %，表明兩者之間具有一定的進化關系。有研究表明，M 基因通常與HA 基因一起進行基因重組，而且M 基因是一個重要的宿主特異性決定性因素[8]。

遷徙鳥類為AIV 的自然宿主，而野生水禽為LPAIV 的主要自然宿主[9]。LPAIV 最早是從鉆水鴨中分離到的，一些野鳥之前接觸過LPAIV，如H9N2 亞型AIV 后，從而可能獲得了對H5N1 亞型AIV 的部分免疫功能[10]。近期，有研究表明野鳥在H5N8 亞型AIV 由亞洲向歐洲、美洲等地的傳播過程中發揮著重要的作用[11-12]。因此，對野鳥，尤其是水禽的AIV 攜帶情況的生物學監測是至關重要的。

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