抗雞傳染性法氏囊病病毒抗體Fab的表達及其中和活性的測定

張瑛杰，尹杰超，李天鶴，周 兵，徐鵬飛，荊 燕,4，任桂萍*，李德山*

(1.東北農業大學生命科學學院生物制藥教研室，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國科學院大學生命科學學院，北京 100049；3.廈門大學公共衛生學院，福建廈門 361005；4.東北農業大學農業生物功能基因重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBD 病毒(IBDV)引起的以損害雛雞中樞免疫器官法氏囊為主要特征的急性接觸性傳染病，是危害養雞業的重要傳染病之一[1]。該病除引起易感雞發病死亡與產蛋性能下降外，還會造成嚴重的免疫抑制和免疫缺陷，增加雞體對其他病原體的易感性，因而常繼發和混合感染多種疾病。IBDV 屬于雙RNA 病毒科雙RNA 病毒屬[2]，主要結構蛋白有4種，其中VP2 是最主要的宿主保護抗原，誘導機體產生中和抗體[3-5]，保護宿主免受IBDV 的感染。隨著生物工程制藥技術的快速發展，具有高專一性、高親和力、高效性和高可塑性的基因工程抗體被應用于疾病的臨床診斷、預防、治療及基礎理論研究等各個領域[6]。Fab 片段是由完整輕鏈(L)和重鏈(Fd)片段組成的異二聚體，大小為完整抗體的1/3，具有較好的穿透力能夠較快的達到組織病灶部位，并且能夠較好地保留結合抗原的活性，因此成為應用較多的一種基因工程抗體[7]。

本實驗通過PCR 擴增獲得抗IBDV 抗體Fab 的L 和Fd 片段基因，將其分別克隆于pET-27b(+)表達載體中，分別表達重組L 蛋白和Fd 蛋白后，利用變性液和復性液將其共復性獲得具有中和活性的抗IBDV 抗體Fab。本研究為研制治療IBD 抗體制劑提供了新的方法和策略。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 peedual-IRES 質粒(含抗IBDV全長抗體基因全序列)、IBDV 高免血清、VP2 蛋白均由本實驗室制備；DF1 細胞、pET-27b(+)載體、E.coli DH5α 及Rosetta(DE3)株均由本實驗室保存；不同IBDV 疫苗株(1-65 株、MB 株、BJ836 株、NF8株、Gt 株和B87 株)購自不同的生物公司；限制性內切酶、T4 連接酶、Taq DNA 聚合酶、pMD18-T 載體及DNA Marker 均購自TaKaRa 公司；HRP 標記的兔抗雞IgG(IgG-HRP)購自eBioscience 公司；引物由Invitrogen 公司合成(表1)。

1.2 抗IBDV抗體Fab重組表達質粒的構建及表達以peedual-IRES 質粒為模板，采用引物P1/P2 和P3/P4 分別PCR 擴增L 和Fd 基因，PCR 產物經測序正確后利用NcoⅠ/Bam HⅠ進行雙酶切，并分別克隆于pET-27b(+)載體中，構建重組質粒pET-L 和pET-Fd，將其分別轉化于Rosetta(DE3)株。重組菌經終濃度0.25 mmol/L 的IPTG 在37 ℃下誘導培養4 h。收集菌體經超聲破碎后離心，分別取上清液和沉淀，進行SDS-PAGE 電泳檢測。

表1 目的片段擴增引物Table 1 Primers used in the amplification of the target gene

1.3 包涵體L及Fd蛋白的變性復性 將L 和Fd片段兩種經變性液(8 mol/L 尿素，pH8.0)過夜變性的包涵體按等摩爾量的比例逐滴共同加入10 倍體積的復性液(2 mol/L 尿素，pH8.0)中，4 ℃12 h 后置于50 mmol/L 的Tris-HCl 中透析48 h。將L 蛋白和Fd 蛋白分別復性透析及共同復性透析后獲得的樣品于4 ℃以12 000 r/min 離心15 min，取20 μL上清，進行SDS-PAGE 檢測，考馬斯亮藍染色、脫色后觀察結果。

1.4 重組抗體Fab的western blot檢測 將L、Fd、Fab 及BSA 樣品各10 μL 經Native-PAGE 電泳并轉印至NC 膜上，在含5%脫脂乳的封閉液中37 ℃封閉2 h，洗膜后加入VP2 蛋白(50 μL/mL)，37 ℃40 min，以IBDV 高免血清為一抗(1∶200)，兔抗雞IgG-HRP 為二抗(1∶7 500)，利用顯影儀曝光顯影，檢測各樣品活性。

1.5 重組抗體Fab的親和力和特異性檢測 將抗IBDV 的Fab 抗體以濃度梯度500 μg/mL、100 μg/mL、20 μg/mL、4 μg/mL 各100 μL 分別包被96 孔板，檢測其對VP2 的結合能力；將濃度為500 μg/mL 的Fab 抗體包被96 孔板檢測Fab 抗體對不同IBDV 株(1-65 株、MB 株、BJ836 株、NF8 株、Gt 株和B87株)的結合能力。設置PBS 組作為背景對照1，未加VP2 蛋白或IBDV 組為陰性對照2，未加高免血清組為陰性對照3，未加HRP 標記兔抗雞二抗組為陰性對照4，利用BSA 代替VP2 蛋白或IBDV 組為陰性對照5，以及包被L 蛋白組為陰性對照6 和包被Fd 蛋白組為陰性對照7。樣品及對照組均設置3 個平行孔。4 ℃包被過夜，采用5 %脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，加入VP2 蛋白(50 μg/mL)或不同IBDV 株(100 μL)，37 ℃1 h，以IBDV 高免血清為一抗(1∶200)，兔抗雞IgG-HRP 為二抗(1∶7 500)，以TMB 底物液避光顯色5 min，終止顯色反應后，酶標儀測定OD450nm值。

1.6 IBDV滴度的測定 將IBDV 疫苗株B87 經10倍倍比稀釋(10-1～10-12)后接種培養于96 孔板中的DF1 細胞單層中，每個稀釋度做8 個復孔，培養5 d～7 d。根據細胞病變(CPE)，按照Reed-Muench方法計算病毒的TCID50。

1.7 重組抗體Fab中和活性的測定 將抗體Fab按2 倍倍比稀釋(500 μg/mL～0.977 μg/mL)，分別與100TCID50的IBDV(B87 株)混合，37 ℃孵育1 h?；旌弦悍謩e加至鋪有單層DF1 細胞的96 孔板中，對照組1 加100TCID50的IBDV，對照組2 加DMEM，對照組3 加L 蛋白和病毒混合液，對照組4 加Fd蛋白和病毒混合液，實驗組和對照組各8 個復孔，于37 ℃5 % CO2培養。逐日觀察CPE 并記錄結果，觀察5 d～7 d。

2 結果

2.1 抗IBDV抗體Fab重組表達質粒的構建及鑒定以peedual-IRES 質粒為模板，P1/P2 和P3/P4 為引物PCR 分別擴增L 和Fd 基因，測序正確后分別克隆于pET-27b(+)載體中，構建重組質粒pET-L 和pET-Fd，PCR 鑒定結果顯示，L 和Fd 基因片段大小分別約為630 bp 和700 bp，與預期結果相符(圖1)。

圖1 重組質粒pET-L 和pET-Fd 的PCR 鑒定Fig.1 PCR product of pET-L and pET-Fd plasmid

2.2 片段L及Fd的誘導表達及純化 將構建的重組質粒pET-L 和pET-Fd 分別轉化于Rosetta(DE3)株進行誘導表達。誘導后菌體經超聲破碎后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE 檢測，結果顯示，重組Rosetta(DE3)菌經誘導后分別在25 ku 和28 ku 處出現目的蛋白條帶，與預期結果一致。并且L 蛋白和Fd 蛋白均以包涵體形式表達(圖2)。轉化空載體的Rosetta(DE3)菌無目的蛋白表達。

圖2 重組L(A)和Fd(B)誘導表達及其純化蛋白(C)的SDS-PAGE 檢測Fig.2 The expressions of L(A),Fd(B)and purification of the proteins(C)detected by SDS-PAGE

2.3 Fab抗體的western blot檢測 L、Fd、Fab 及BSA 樣品進行Native-PAGE 后，轉膜封閉，進行western blot 檢測，結果顯示共復性后的Fab 大小約為50 ku，并且可與VP2 蛋白特異性結合，而單獨復性獲得的L 蛋白、Fd 蛋白及BSA 不能與VP2 蛋白結合(圖3)。

2.4 重組抗體Fab的親和力和特異性檢測 使用VP2 蛋白和不同IBDV 疫苗株對共復性獲得的抗體Fab 進行ELISA 檢測。結果顯示，OD450nm值隨抗體Fab 濃度的遞增呈現上升趨勢，具有劑量依賴性。樣品組與PBS 組及陰性對照組相比差異極顯著(p<0.01)，表明抗體Fab 對VP2 蛋白和不同IBDV 疫苗株均具有特異性結合能力，并且抗體Fab 對不同IBDV 疫苗株具有不同的結合能力(圖4)。

圖3 Fab 抗體的western blot 分析Fig.3 The identification of Fab by western blot

圖4 Fab 抗體的ELISA 檢測Fig.4 Fab detected by ELISA

2.5 重組抗體Fab中和活性的測定 將連續倍比稀釋的抗體Fab 與100TCID50(TCID50=10-8.4/0.1 mL)的IBDV(B87 株)混合孵育，進行中和活性的測定，結果顯示，L 蛋白及Fd 蛋白均無中和活性，而抗體Fab 具有中和活性，其阻斷病毒侵染DF1 細胞的最小濃度為3.906 μg/mL(表2)。

表2 抗IBDV(B87 株)抗體Fab 中和活性的檢測Table 2 Neutralization tests of the Fab antibody against IBDV(B87 strian)

3 討論

近年來，由于IBDV 超強毒株和變異株的出現[8-10]，使得IBD 的發生和流行呈現出新的特點，加大了診斷和防制的難度[8]。目前，IBD 已遍布全球各地區，成為威脅世界養禽業最重要的疾病之一[11]。一般使用卵黃抗體和高免血清進行治療，然而，因高免血清造價昂貴很少大規模使用，而卵黃抗體也存在一些不可避免的弊端[12]，如可能攜帶傳染病病原體(如減蛋綜合癥、禽白血病、支原體等)，在應用時會產生過敏反應，發病晚期應用療效差等因素，這些嚴重影響了卵黃抗體的應用?；蚬こ炭贵w作為以蛋白為基礎的靶向診斷和治療用生物制品，在病毒性疾病防制方面備受重視[13]。

本研究利用基因工程重組技術，通過PCR 擴增的方法獲得了抗IBDV 抗體Fab 的L 及Fd 片段，將它們分別克隆到表達載體pET-27b(+)中進行表達，共復性后獲得了具有天然構象的重組抗體Fab。Western blot 結果表明L 蛋白與Fd 蛋白能夠通過共復性的方法利用鏈間二硫鍵結合在一起獲得大小約為50 ku 的抗IBDV 抗體Fab，并且其可以與IBDV VP2 蛋白特異性結合。ELISA 檢測結果顯示抗IBDV抗體Fab 對VP2 蛋白及不同IBDV 疫苗株具有特異性結合能力，而且其對不同病毒株具有不同的結合能力，其結合能力大小依次為B87 株>1-65 株>BJ836 株>Gt 株>MB 株>NF8 株。體外中和試驗結果表明獲得的抗體Fab 具有中和活性，其能夠阻斷或抑制IBDV(B87 株)對DF1 細胞的侵染作用，其阻斷病毒的最小蛋白濃度為3.906 μg/mL。

抗體Fab 作為新型基因工程重組抗體之一，有望成為治療病毒類疾病的候選藥物[14]。本研究首次獲得了具有中和活性的抗IBDV 抗體Fab，為后續研制IBD 治療性抗體提供了理論與技術支持。

[1]Hermann M,Md R I,Rudiger R.Research on infectious bursal disease the past,the present and the future[J].Vet Microbiol,2003,97(l-2):153-165.

[2]陸承平.最新脊椎動物病毒分類簡介[J].中國獸醫學報，1996，16(1)：94-100.

[3]Parry D A.Coiled-coils in a-helix-containing proteins:analysis of the residue types within the heptad repeat and the use of these data in the prediction of coiled-coils in other proteins[J].Bio Sci Rep,1982,2(12):1017-1024.

[4]Engelman D M,Steitz T A,Goldman A.Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of membrane proteins[J].Ann Rev Biophys Biophys Chem,1986,15:321-353.

[5]曾祥偉，王笑梅，高宏雷，等.傳染性法氏囊病超強Gx 株的致弱研究[J].中國預防獸醫學報，2003，25(2)：140-144.

[6]劉向昕，展德文，張兆山.細菌表面展示技術的應用研究進展[J].微生物學免疫學進展，2005，33(2)：70-73.

[7]王小英，林紅，張慧林，等.人源抗Trop-2 抗體Fab 的制備及條件優化[J].南京醫科大學學報(自然科學版)，2012，32(1)：35-39.

[8]Brandt M,Yao Kun,Liu Mei-hong,et al.Molecular determinants of virulence,cell tropism,and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus[J].J Virol,2001,75(24):11974-11982.

[9]李德山，武志強，陳冠春，等.雞傳染性法氏囊病超強毒毒株德分離和初步鑒定[J].中國畜禽傳染病，1996，61(6)：3-6.

[10]Brown M D,Skinner M A.Coding sequences of both genome segments of a European very virulent infectious bursal disease virus[J].Virus Res,1996,40(1):1-15.

[11]Sapats S I,Heine H G,Trinidad L,et al.Generation of chicken single chain antibody variable fragments(scFv)that differentiate and neutralize infectious bursal disease virus(IBDV)[J].Arch Virol,2003,148:497-515.

[12]Mine Y,Kovacs-Nolan J.Chicken egg yolk antibodies as therapeutics in enteric infectioudiseasse:a review[J].J Med Food,2002,5:159-169.

[13]周兵，李天鶴，李寧，等.抗雞傳染性法氏囊病病毒單鏈抗體庫的構建及其中和抗體的篩選[J].中國預防獸醫學報，2014，36(3)：227-231.

[14]劉美君，高向東，徐晨.Fab 類抗體的研究進展[J].國際藥學研究雜志，2014，41(3)：318-324.