黃顙魚維氏氣單胞菌體內誘導基因的篩選

單曉楓，康元環，徐 洋，潘曉藝，沈錦玉*，錢愛東

(1.浙江省淡水水產研究所農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江湖州 313001；2.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春 130118)

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)廣泛分布于自然環境中，不同分離菌株的毒力有強弱之分，其中強毒菌株可以感染多種動物，是一種人-獸-魚共患病原菌[1]。近年來，有關該菌引發疾病的報道逐年增多，尤其是水生生物感染的病例，呈顯著上升趨勢，已給水產養殖業帶來較大的經濟損失[2-4]。目前，有關A.veronii 毒力因子及致病機理的研究并不多見且不夠深入，疫苗的研究也鮮有報道，這給該菌引發疾病的防治帶來較大困難。

體內誘導基因(In vivo-induced gene)是病原菌在感染宿主過程中被誘導表達的基因，其編碼蛋白往往在致病過程中具有重要意義，并且有可能成為良好的保護性抗原。目前，已有多種方法可以篩選體內誘導基因，其中，體內誘導抗原技術(In vivoinduced antigen technology，IVIAT)以其無需動物模型、簡單、快捷等優點而逐漸受到重視并應用[5]。

本研究以黃顙魚源A.veronii 為實驗材料，利用IVIAT 技術篩選其體內誘導抗原，為深入了解A.veronii 致病的分子機制以及疫苗研發所用保護性抗原的篩選奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物 黃顙魚A.veronii TH0426 株和兔抗黃顙魚IgM 血清由浙江省淡水水產研究所徐洋惠贈；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)及pET-30a/b/c 表達載體均由本實驗室保存；黃顙魚(約100 g/尾)購自吉林省某養殖場。

1.2 主要試劑 Sau3AⅠ、T4 連接酶、Ex Taq DNA聚合酶等均購自TaKaRa 公司；質粒抽提試劑盒購自北京索萊寶生物公司；蛋白酶抑制劑購自AMRESCO 公司；EasySeeTMII Western Marker 購自北京全式金生物技術有限公司；X-OMAT BT 醫用X 射線膠片購自伊士曼柯達公司。

1.3 半數致死量(LD50)的測定 將A.veronii TH0426株活化、培養，并稀釋菌液至2×108cfu/mL、2×107cfu/mL、2×106cfu/mL、2×105cfu/mL、2×104cfu/mL、2×103cfu/mL，每個梯度接種10 尾黃顙魚(0.2 mL/尾)，對照組注射0.2 mL 生理鹽水，連續觀察14 d，觀察并記錄黃顙魚死亡時間與數量，依據改良寇氏法計算A.veronii TH0426 的LD50。

1.4 人工感染A.veronii黃顙魚血清的制備與吸附采用LD50(4.0×104cfu/mL)的A.veronii 人工感染黃顙魚，采集感染后7 d、14 d、21d 的血清，采用ELISA方法檢測其抗體效價[6]，分裝-80 ℃保存備用。

將收集的血清混合，利用體外培養的A.veronii TH0426 和宿主菌BL21(DE3)、兩者菌體裂解物以及其熱變性裂解物分別與血清混合進行吸附處理，具體操作參照文獻[7]的方法，并略有改進。同時檢測處理前后血清的抗體變化，當血清抗體效價與陰性血清抗體效價接近且不再發生變化時，可視為血清處理合格，此時將血清-80 ℃保存、備用。

1.5 A.veronii基因組表達文庫的構建與鑒定 提取A.veronii TH0426 基因組DNA，采用Sau3AⅠ酶切，純化回收100 bp～4 000 bp 的片段；分別克隆至去磷酸化的pET-30a/b/c 3 種表達載體中，并電轉至DH5α，檢測片段插入率及大??；提取重組質粒，電轉化入BL21(DE3)，并將轉化產物涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB 平板上，記錄每個平板上轉化子個數，依據文獻[8]計算基因組文庫容量，當菌落數達到文庫所需要求，收集菌落并-80 ℃保存，基因組文庫構建完成。

設計并合成pET-30 載體的T7 啟動子特異性引物：Pf：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'/Pr：5'-G CTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。隨機挑取基因組文庫部分菌落，擴增并提取質粒，PCR 鑒定，對片段插入率和片段大小進行分析。

1.6 表達文庫的免疫篩選 利用已標記的滅菌NC膜將文庫菌落轉移至含有卡那霉素(50 μg/mL)和IPTG(1 mmol/L)LB 平板上，37 ℃誘導表達4 h～6 h后，將表達后的NC 膜置于氯仿蒸氣中15 min～30 min，4 ℃封閉過夜，采用菌落原位免疫雜交進行篩選，根據顯色確定陽性克隆在母板中的位置。

將初步篩選的陽性菌落再次點到NC 膜上，按初篩步驟再次篩選，反復2～3 次。將最終篩選后確定的陽性克隆甘油-80 ℃保存；同時將陽性克隆由深圳華大基因科技有限公司測序，測序結果去除載體序列，并利用相關生物學軟件進行分析。

2 結果

2.1 血清吸附效果檢測 混合血清分別與體外培養的A.veronii TH0426 和宿主菌BL21(DE3)、兩者菌體裂解物以及其熱變性裂解物反復吸附處理后，進行ELISA 檢測，結果顯示其OD490nm由3.32 降到0.77，表明混合血清得到了較好的吸附(圖1)。

圖1 吸附處理血清的ELISA 檢測結果Fig.1 The ELISA detection after six sequential steps in adsorption of pooled sera

2.2 基因組DNA酶切條件確定 通過限制性內切酶Sau3AⅠ酶切，酶切條件為：酶量0.16 U、37 ℃45 min 酶切1 μg 基因組DNA 可產生最佳大小片段(圖2)。按此條件大量酶切A.veronii TH0426 基因組、并回收100 bp～4 000 bp 的片段。

圖2 A.veronii TH0426 基因組酶切產物Fig.2 Digestion of A.veronii TH0426 genome with restriction enzyme Sau3AⅠ

2.3 基因組表達文庫的構建與鑒定 將回收的A.veronii TH0426 基因組酶切片段分別克隆至載體pET-30a/b/c 中，并電轉入宿主菌中，統計轉化子，約4.9×104個克隆。依據基因組文庫容量計算公式，構建A.veronii TH0426 文庫克隆數約10 360 個，符合庫容量要求。

隨機挑取菌落進行PCR 鑒定，結果顯示：可以擴增出100 bp～4 000 bp 目的片段，陽性克隆率約為95.3 %(圖3)。

圖3 A.veronii TH0426 基因組表達文庫插入片段大小及插入率分析Fig.3 Analysis of size of insertion fragments and insertion ratio of A.veronii TH0426 expression library

2.4 基因組表達文庫的免疫篩選 文庫菌落經菌落原位免疫雜交進行篩選，結果顯示，初篩共獲得15個疑似陽性克隆(圖4)；通過2 次復篩，最終獲得了5 個陽性克隆(圖5)。

圖4 利用IVIAT 初篩基因組文庫Fig.4 The first round screening the genomic expression library by IVIAT with the antisera to A.veronii

2.5 序列同源性比對 經原位雜交篩選的陽性克隆經測序、BLAST 比對、ORF Finder 分析顯示，最終確定了5 個開放閱讀框(ORF)，分別為核苷酸通透酶nupC 基因、多藥轉運蛋白matE 基因、羧基肽酶cpg2 基因、Ⅲ型分泌系統ascV 基因以及保守假想蛋白基因(表1)。

圖5 利用IVIAT 復篩基因表達文庫Fig.5 Re-screening the genomic expression library by IVIAT with the antisera to A.veronii

表1 篩選出的體內誘導基因Table 1 In vivo genes identified by IVIAT

3 討論

IVIAT 是一種篩選、鑒定病原菌體內誘導表達基因的技術，病原菌的這些體內誘導表達基因可能與其生存、致病密切相關，對其進行深入研究，有助于闡明病原菌的致病機理。A.veronii 雖然是一種人-獸-魚共患病原菌，但有關其致病機制的研究尚無報道，對A.veronii 的體內誘導基因的篩選與鑒定，可為闡明其致病機理奠定基礎；而篩選到的這些體內誘導表達基因均具有免疫原性，其中部分基因甚至可能作為基因工程疫苗的候選靶基因。

目前，有關A.veronii 體內誘導表達基因的研究，除本實驗室對狐源A.veronii 的體內誘導基因進行篩選鑒定外，尚未見其它報道。本研究以黃顙魚源A.veronii 為研究材料，篩選到5 個ORF，其中，Ⅲ型分泌系統ascV 基因，本實驗室在篩選狐源A.veronii 體內誘導基因時也獲得了該基因，表明Ⅲ型分泌系統可能在A.veronii 致病中起一定作用，但ascV 基因是否為不同動物源性A.veronii 體內誘導基因，還需要進一步擴大樣本量來證實；其它4 個ORF 與狐源A.veronii 的體內表達基因并不相同，這可能與A.veronii 的動物源性、篩選的基礎克隆數不同有關；而這4 個ORF 除一種為假想蛋白，尚不知其功能外，核苷酸通透酶nupC 基因在病原菌核酸的體內代謝及運輸等方面發揮一定作用[9]；羧基肽酶cpg2 是一種細菌酶類，現多應用于人類腫瘤的治療中，其在A.veronii 感染中起到何種作用，則需要進一步研究；多藥轉運蛋白MatE 則是一種細菌的耐藥泵，其作用的抗生素底物有氨基糖苷類、氯霉素類以及氟喹諾酮類，可以幫助病原菌向細胞外泵出這類抗生素[10-11]，黃顙魚源A.veronii 存在這種蛋白，暗示該菌可能對這些抗生素產生耐藥性，并且可以在動物機體內抵御這些藥物，從而影響藥效。

體內誘導抗原是病原菌在體內表達的一種特異性抗原，病原菌在體內致病過程中其可能發揮作用，對其進行深入研究，將有助于揭開A.veronii 的致病機理；同時，也可以作為候選保護性抗原，為A.veronii 疫苗的研發提供實驗材料。

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