豬輪狀病毒(G9型)Taq Man熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

王宇飛，時洪艷，朱向東，陳建飛，袁 婧，張 鑫，石 達，劉建波，王瀟博，高 晶，馮 力*

(1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150001；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/豬消化道團隊，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319)

豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavirus)成員，是引起仔豬發生病毒性腹瀉的主要病原體，給養豬業造成了嚴重的經濟損失[1-2]。

PoRV 為雙股多節段RNA 病毒，成熟的病毒粒子包括11 個節段的雙股RNA，分別編碼6 種結構蛋白(VP7、VP4、VP6、VP1、VP2、VP3)和6 種非結構蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/6)[3]。PoRV 包括多種血清型和基因型，根據VP7 基因序列差異可以分為24 個G 基因型，根據VP4 基因序列差異可以分為34 個P 基因型。對人源自然重配病毒株的研究表明，G9 基因型PoRV 最適宜在人體內增殖并具有廣泛流行的趨勢[4-5]。分子流行病學分析表明，G9 型PoRV 的流行近年來呈現上升趨勢，因此，本研究以PoRV NMTL 株VP7 基因保守序列為靶基因，建立了靈敏和特異的Taq Man 熒光定量RT-PCR 檢測技術，對于該病的早期診斷和流行病學調查具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞及病料樣品 G9 型PoRV NMTL株、G5 型PoRV OSU 株、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2 型(PCV2)等病毒株均由本實驗室保存；MA-104 細胞購自ATCC；臨床表現嚴重腹瀉的仔豬小腸內容物等臨床病料樣品采集自河南、北京、河北等地的豬場。

1.2 主要試劑 One Step Premix PrimeScriptTMRTPCR Kit(Perfect Real Time)和血液/細胞/組織基因組RNA 提取試劑盒購自Qiagen 公司。

1.3 引物設計與合成 參考GenBank 中登錄的G9型PoRV NMTL 株序列(JF781163)，以VP7 保守區序列設計PoRV(G9)F/R 上下游引物(5'-CTGATGTTG TCGATGGTGTAAACC-3'/5'-TCAGTTTGTGGTGCAG TGGTTG-3')和探針(5'-FAM-CCGCCGTAATATCTA ACACTTCTGAGCCACC-BHQ1-3')，引物和探針均由上海Invitrogen 公司合成。

1.4 病毒的TCID50測定 將G9 型PoRV NMTL 株細胞適應毒進行10 倍系列稀釋，接種培養于96 孔細胞培養板MA-104 細胞單層中，并設立無病毒液細胞對照組，37 ℃5%CO2條件下培養，利用Karber法計算其TCID50。

1.5 Taq Man熒光定量RT-PCR檢測方法的建立取104TCID50的病毒液按照RNA 提取試劑盒使用說明提取其總RNA，測定其濃度和純度。將1.8≤OD260nm/OD280nm≥2.0 且OD260nm/OD230nm>2.0 的RNA 樣品進行10 倍系列稀釋，使其所對應的終濃度為104～10-4TCID50/mL，以其為標準品，并對反應條件進行優化，繪制標準曲線并評價。

1.6 特異性試驗 分別以PoRV(G5)、TGEV、PEDV、PRRSV 和PCV2 等常見豬病病原制備的DNA 或RNA 為模板按照最佳反應體系進行檢測，同時以G9 型PoRV NMTL 株RNA 樣品為陽性對照，設立無模板陰性對照，以評價該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 以104TCID50的病毒液抽提后RNA 10 倍系列稀釋樣品為模板進行Taq Man 熒光定量RT-PCR 和普通RT-PCR 檢測，以確定兩種檢測方法的敏感性差異。

1.8 重復性試驗 以同一批次和不同批次提取的病毒RNA 為模板，分別進行組內和組間的重復性試驗，對實驗數據進行統計學分析，以評價該方法的穩定性。

1.9 臨床樣品檢測 將采集自河南、北京、河北等地區臨床表現為嚴重腹瀉的仔豬小腸內容物等臨床病料樣品共45 份，利用建立的Taq Man 熒光定量RT-PCR 和普通RT-PCR 進行檢測，比較兩種檢測方法的符合率。

2 結果

2.1 病毒的TCID50測定 G9 型PoRV NMTL 株細胞適應毒系列稀釋并接種培養于96 孔細胞培養板MA-104 細胞單層中，37 ℃5 % CO2條件下培養，利用Karber 法計算其TCID50為l0-4.5/0.1 mL(表1)。

表1 TCID50計算Table 1 Calculation of virus titer by TCID50

2.2 G9型PoRV Taq Man熒光定量RT-PCR方法的建立 對引物探針濃度、退火溫度等條件進行優化，確定最佳反應體系(20 μL)為：模板RNA 1 μL，2×One Step RT-PCR Buffer Ш 10 μL，Ex Taq HS 0.4 μL，RT-Enzyme MixⅡ0.4 μL，探針(10 pmol/μL)1 μL，PoRV(G9)F/R(10 pmol/μL)各1 μL，RNase Free H2O 5.2 μL。最佳反應條件為：50 ℃10 min，95 ℃5 min；95 ℃10 s、60 ℃45 s，共45 個循環。該方法在RNA 標準品所對應的病毒含量為104～10-3TCID50/μL之間呈現良好的線性關系，擴增效率為0.955，相關系數R2為0.991，斜率為-3.436，截距為39.90，以起始模板的對數作為X 軸，Ct 值為Y 軸做回歸曲線，得到回歸方程：Y=-3.436X+39.90(圖1)。

圖1 G9 型PoRV Taq Man 熒光定量RT-PCR 標準曲線Fig.1 Standard curve of Taq Man real-time RT-PCR for detection of PoRV(G9)

2.3 特異性試驗結果 采用建立的Taq Man 熒光定量RT-PCR 方法同時檢測TGEV、PEDV、PRRSV、PoRV(G5)和PCV2 等豬病常見病原，同時以G9 型PoRV NMTL 株RNA 作為陽性對照，以RNase Free H2O 為陰性對照進行檢測。結果顯示只有以G9 型PoRV RNA 為模板時，能夠產生典型的擴增曲線，其它樣品及陰性對照均不能產生擴增曲線(圖2)，表明所建立的Taq Man 熒光定量RT-PCR 方法具有良好的特異性。

圖2 PoRV 熒光定量RT-PCR 特異性試驗Fig.2 Specific test of the PoRV real-time RT-PCR

2.4 敏感性試驗結果 以104TCID50的病毒液抽提后的RNA 系列稀釋樣品為模板進行Taq Man 熒光定量RT-PCR 和普通RT-PCR 檢測，結果顯示，Taq-Man 熒光定量RT-PCR 能檢測到10-3TCID50所含的RNA，比普通RT-PCR 靈敏度高約1 000 倍(圖3)。

圖3 Taq Man 熒光定量RT-PCR(A)與普通RT-PCR(B)敏感性比較Fig.3 Comparison of detection limits of Taq Man real-time RT-PCR(A)and conventional RT-PCR(B)

2.5 重復性試驗結果 以同一批次和不同批次提取的RNA 進行組內和組間重復性擴增試驗，結果顯示該重復性試驗變異系數均小于0.87 %，表明該熒光定量RT-PCR 檢測方法的穩定性高，重復性好(表2)。

2.6 臨床樣品檢測結果 將采集自河南、北京、河北等地區臨床病料樣品共45 份應用建立的Taq Man熒光定量RT-PCR 方法和普通RT-PCR 方法對其進行檢測，結果顯示陽性率分別為64.4 %(29/45)和44.4 %(20/45)，兩者總符合率為80 %。表明建立的Taq Man 熒光定量RT-PCR 的方法敏感性更高。

表2 熒光定量RT-PCR 的組內和組間重復性試驗結果Table 2 Intra-assay and inter-batch reproducibility test of real-time PCR

3 討論

仔豬輪狀病毒性腹瀉是由PoRV 引起的一種以腹瀉、厭食、嘔吐、脫水為特征的傳染病，該病易繼發其它細菌性感染，導致仔豬死亡率升高或生長緩慢，給養豬業造成嚴重的經濟損失[6-7]。在我國，PoRV 感染非常普遍，幾乎所有豬場的母豬血清中均可檢測到PoRV 抗體；分子流行病學調查也表明，G9 型PoRV 已在我國廣泛流行，嚴重制約我國養豬產業的發展[4,8]。

RNA 病毒大多報道均以重組質粒DNA 作為標準品建立檢測方法，但由于反轉錄效率并非100 %，造成該方法所計算的拷貝數比真實值略高。本研究以TCID50作為病毒的量化單位對病毒含量進行衡量，所得結果更加準確可靠，有效避免了因反轉錄所造成的系統誤差，比以重組質粒為標準品建立標準曲線的方法更加科學。

本研究以G9 型PoRV NMTL 株的RNA 為標準品，進行系列稀釋，建立了G9 型PoRV Taq Man 熒光定量RT-PCR 檢測方法。該方法特異性好，對常見的除G9 型PoRV 以外的豬病病原檢測均為陰性；該方法靈敏性高，檢測下限為10-3TCID50，比普通RT-PCR 敏感性高約1 000 倍；組內和組間重復性試驗Ct 值變異系數均小于0.87 %，重復性好。因此，本實驗所建立的G9 型PoRV Taq Man 熒光定量RT-PCR 檢測方法具有特異、靈敏、穩定的特點，可以用于臨床樣品的定量和定性檢測，為PoRV 的流行病學調查和早期診斷奠定了基礎。

[1]倪艷秀，林繼煌，何孔旺，等.A 組輪狀病毒研究動態[J].中國獸醫學報，1998，14(1)：60-64.

[2]時洪艷，陳建飛，王承寶，等.豬輪狀病毒Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/G9P[23]株的分離與鑒定[J].中國預防獸醫學報，2011，33(9)：681-684.

[3]Haffeiee I E.The epidemiology of rotavirus infections:a global perspective[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,1995,20(3):275-286.

[4]Shi Hong-yan,Chen Jian-fei,Li Hui-xin,et al.Molecular characterization of a rare G9P[23]porcine rotavirus isolate from China[J].Arch Virol,2012,157(10):1897-1903.

[5]Abe M,Ito N,Morikawa S,et al.Molecular epidemiology of rotaviruses among healthy calves in Japan:isolation of a novel bovine rotavirus bearing new P and G genotypes[J].Virus Res,2009,144:250-257.

[6]Ursu K,Kisfali P,Rigo D,et al.Molecular analysis of the VP7 gene of pheasant rotaviruses identifies a new genotype,desig-nated G23[J].Arch Virol,2009,154(8):1365-1369.

[7]Prasad B V,Wang G J,Clerx J P,et al.Three dimensional structure of rotavirus[J].J Mol Biol,1988,199:269-275.

[8]王璐，時洪艷，陳建飛，等.2011 年～2012 年G9 型豬輪狀病毒流行病學調查及VP7 基因遺傳進化分析[J].中國預防獸醫學報，2013，35(4)：276-279.