同時檢測CSFV、PRRSV、PRV及PCV2多重熒光定量PCR方法的建立

何世成，周其偉，張浩旭，王衛國，魯信花，唐小明，周玲玲

(1.湖南省動物疾病預防控制中心，湖南長沙 410007；2.中山大學達安基因股份有限公司，廣東廣州 510665；3.廣東中大南海海洋生物技術工程中心有限公司，廣東廣州 510330)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)和豬圓環病毒2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是4 種主要的引起豬繁殖障礙的傳染病病原。在規?；图s化的大中型豬場中，繁殖障礙性疾病已成為最重要的疫病之一，并給養豬業造成了嚴重的經濟損失[1-2]。其中CSFV、PRRSV 和PCV2 主要損害豬的免疫系統，降低機體的免疫力，從而造成其他病原的混合感染。當豬同時感染上述兩種或多種病原體時，疾病的臨床癥狀和病變將明顯加重[3-7]。由于CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 這4 種病毒感染后具有相似的臨床癥狀且易混合感染致病，因此給豬繁殖障礙性疾病的診斷帶來一定的困難。因此，建立一種同時快速檢測這4 種病原體的方法具有重要的應用價值。

在病原學診斷方法中，熒光定量PCR 方法具有特異性強、敏感性高、快速及高通量等優點，并可以對病原進行定量檢測，已廣泛應用于疾病診斷和鑒別診斷方面[8-10]。鑒于豬繁殖障礙疾病的復雜性，本研究利用4 種不同的熒光素分別標記CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 特異性探針建立了一種用于同時檢測這4 種病原的多重熒光定量PCR 方法，為這4 種病原的早期及鑒別檢測提供了新的方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和臨床樣本 CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬口蹄疫病毒(FMDV)均由本實驗室保存；豬輪狀病毒(RV)標準株購自中國獸醫微生物菌株保藏管理中心。59 份疑似豬繁殖障礙疾病樣本，包括死胎、流產胎兒、仔豬的淋巴結、扁桃體、肺和脾，為本實驗室保存，樣本收集于2013 年6 月～2013 年9 月湖南省多個豬場。

1.2 主要試劑 QIAamp cador Pathogen Mini Kit 和QIAquick PCR Purification Kit 購 自QIAGEN 公 司；pGEM-18T 載體和pMD18-T 載體購自Promega 公司；in vitro Transc-ription T7 Kit 購自寶生物工程(大連)有限公司；一步法熒光RT-PCR 試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司；100 bp DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司；Top10 感受態細胞、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和質粒抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 引物和探針設計 根據GenBank 中登錄的CSFV、PRRSV、PPV 和PCV2 序列[9]，分析各個病毒的保守區，應用Primer Express3.0 軟件，根據每種病毒基因的保守區基因設計特異性的引物及探針，并通過NCBI 的BLAST 功能對其特異性進行初步鑒定。引物和探針均由Invitrogen 公司合成，4 條探針分別用FAM、HEX、CY5 和Texas Red 標記，以便于在檢測中區分。引物和探針序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer and probe sequences

1.4 核酸提取 標準株及液體樣本按照病毒QIAamp cador Pathogen Mini Kit 說明書，進行核酸提取。如果為組織病料樣本，需液氮研磨后進行核酸提取。

1.5 陽性標準品的制備

1.5.1 DNA 病毒陽性標準品的制備 應用One Step RT-PCR 試劑盒，以PRV 和PCV2 標準株核酸為模板擴增各目的片段。

PCR 產物經電泳檢測后按照凝膠回收試劑盒說明書純化回收目的片段。將PRV 和PCV2 的目的片段分別克隆至pMD18-T 載體中，測序驗證正確的重組質粒作為熒光定量PCR 的重組質粒標準品，用紫外分光光度計測其OD260nm，計算拷貝數[11]，-20 ℃保存備用?？截悢?質粒濃度×6.02×1023/(660×質?？傞L度)。

1.5.2 RNA 病毒陽性標準品的制備 應用One Step RT-PCR 試劑盒以CFSV 和PRRSV 標準株核酸為模板，PCR 擴增各目的片段。PCR 產物經凝膠電泳檢測后純化回收目的片段，并將各目的片段分別克隆至pGEM-T 載體中，構建重組質粒，對其進行測序驗證。采用SpeⅠ分別將測序正確的重組質粒進行線性化處理，酶切產物用QIAquick PCR Purification Kit 進行純化，然后按照in vitro Transcription T7 Kit說明書進行RNA 合成。對轉錄產物純化后，用紫外分光光度計測其OD260nm，計算RNA 濃度，計算拷貝數[12]，-20 ℃保存備用?？截悢?6.02×1023(拷貝/μL)×RNA 濃度(g/μL)/質量MW(g/mol)，其中，MW=RNA 堿基數(bp)×330 daltons/bp。

1.6 熒光定量PCR方法建立與優化 熒光定量PCR 反應體系(50 μL)組成如下：2×多重一步法RT-PCR Mix 25 μL，CFSV、PRRSV、PRV 和PCV2引物和探針終濃度分別為：上下游引物各10 μM，探針各3 μM，模板5 μL，ddH2O 補足至50 μL。反應條件為：50 ℃15 min，95 ℃15 min；94 ℃15 s、58 ℃45 s，45 個循環。根據以上的基本反應及擴增條件，以各自的陽性病毒株核酸為模板，分別對引物濃度范圍(6 μM～12 μM)、探針濃度范圍(1 μM～5 μM)和退火溫度(55 ℃～60 ℃)進行優化。

1.7 標準曲線的建立 將已定值的CSFV、PRRSV體外轉錄RNA 和PRV、PCV2 重組質粒均稀釋至1×105拷貝/μL，再10 倍系列稀釋4 個梯度，以1×101拷貝/μL～1×104拷貝/μL 的稀釋液為模板每個梯度重復2 次，進行多重熒光定量PCR 反應，建立各自標準曲線，計算相關系數。

1.8 熒光定量PCR的特異性分析 采用所優化后的方法對 CFSV、PRRSV、PRV、PCV2、JEV、PEDV、TGEV、FMDV 和RV 的核酸進行檢測，以驗證該方法的特異性。

1.9 靈敏度試驗 將已定值的CSFV、PRRSV 體外轉錄RNA 和PRV、PCV2 重組質粒均稀釋至1×105拷貝/μL，再10 倍系列稀釋5 個梯度，以1×100拷貝/μL～1×104拷貝/μL 的稀釋液為模板，每個梯度重復2 次，進行多重熒光定量PCR 反應，確定其靈敏度。

1.10 重復性試驗 取1×105拷貝/μL、1×103拷貝/μL 和1×101拷貝/μL 3 個濃度的RNA 進行3 次批內和批間平行試驗，計算變異系數(CV)，判定該方法的重復性。

1.11 臨床樣品檢測應用 采用所建立的熒光定量PCR 方法，對59 例臨床樣本中的CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 病原體進行檢測。

2 結果

2.1 陽性標準品的制備 CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 這4 種病毒的PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示均擴增出目的片段(圖1)。經測序，PCR 產物序列與參考序列的同源性為100 %。PRV、PCV2 的重組質粒和體外轉錄合成的CSFV 和PRRSV RNA，CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 的OD260nm/OD280nm和濃度分別為：1.89×1012拷貝/μL、3.36×1012拷貝/μL；2.07×1011拷貝/μL、8.48×1011拷貝/μL；1.75×1011拷貝/μL、7.09×1011拷貝/μL；1.97×1011拷貝/μL、3.36×1011拷貝/μL。

圖1 CSFV,PRRSV,PRV and PCV2 PCR 產物Fig.1 Amplifications of target DNA fragment from CSFV,PRRSV,PRV and PCV2 gene by PCR

2.2 熒光定量PCR方法建立與優化 以CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 的核酸為模板進行熒光定量PCR 擴增，優化篩選最佳的引物和探針濃度。最終確定最優的反應體系為：2×多重一步法RT-PCR Mix 25 μL，引物和探針用量分別為：CFSVF(20 μM)和CFSVR(20 μM)各0.4 μL、PRRSVF(20 μM)和PRRSVR(20 μM)各0.5 μL、PRVF(20 μM)和PRVR(20 μM)各0.4 μL、PCV2F(20 μM)和PCV2R(20 μM)各0.4 μL，CSFV-Probe(20 μM)0.15 μL、PRRSV-Probe(20 μM)0.25 μL、PRV-Probe(20 μM)0.15 μL、PCV2-Probe(20 μM)0.1 μL，模板5 μL，最后用ddH2O 補足至50 μL。

最佳擴增條件確定為：50 ℃15 min，95 ℃15 min；94 ℃15 s、59 ℃45 s，45 個循環。

2.3 熒光定量PCR標準曲線的建立 將1×105拷貝/μL 的CSFV、PRRSV 體外轉錄RNA 和1×105拷貝/μL 的PRV、PCV2 的重組質粒10 倍系列稀釋5個梯度，以1×101拷貝/μL～1×104拷貝/μL 的稀釋液為模板進行熒光定量PCR 擴增，以濃度為橫坐標，以其對應的Ct 值為縱坐標，得到4 條標準曲線(圖2)；CSFV 的斜率(Slope)、線性相關系數R2和擴增效率E 分別為：-3.731，0.998 和0.854；PRRSV的Slope、R2和E 分別為：-3.623，0.999 和0.888；PRV 的Slope、R2和E 分別為：-3.901,0.998 和0.802；PCV2 的Slope、R2和E 分別為：-3.812，0.995和0.829。

圖2 熒光定量PCR 體系標準曲線Fig.2 Standard curve of real-time PCR

2.4 熒光定量PCR特異性驗證 以CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2、JEV、TEGV、PEDV、FMDV 和RV為檢測對象，經熒光定量PCR 檢測后，只有CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 在各自的檢測通道有信號，其他樣本無交叉反應發生(圖3)。

2.5 熒光定量PCR敏感性試驗 將已定值CSFV、PRRSV 體外轉錄RNA 和PRV 和PCV2 的重組質粒以1×100拷貝/μL～1×104拷貝/μL 的稀釋液為模板進行熒光定量PCR 擴增，檢驗該體系對各病毒模板的敏感度，由擴增曲線可以看到每種病毒的1×100拷貝/μL 濃度均未檢出，而1×101拷貝/μL 濃度均可被檢測出來，因此確定1×101拷貝/μL 濃度為本方法的最低檢出量(圖4)。

圖3 熒光定量PCR 體系特異性Fig.3 Sensitivity test of real-time PCR

圖4 熒光定量PCR 體系敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of real-time PCR

2.6 重復性試驗 為檢驗該方法的重復性，用1×105拷貝/μL、1×103拷貝/μL 和1×101拷貝/μL 3 個濃度的稀釋液進行3 次批內和批間平行試驗。計算Ct 值的變異系數(CV)，得到批內試驗和批間試驗的CV 均小于4 %(表2)。

表2 熒光定量PCR 方法的重復性試驗結果Table 2 Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the the real-time PCR assay

2.7 臨床樣本分析 以建立的熒光定量PCR 方法對59 份臨床樣本進行了檢測，結果見表3，表明本研究建立的方法可用于臨床樣品檢測。

表3 59 份病料樣品熒光定量PCR 的檢測結果Table 3 The results of the real-time PCR tested of 59 cases

3 討論

引起豬繁殖障礙性疾病的病原較為復雜，其中CSFV、PRV、PRRSV 和PCV2 為最主要的病毒[13-14]。臨床上對于鑒別診斷CSFV、PRV、PRRSV 和PCV2引起的感染性疾病一直都存在很大的難度。PRV 和PCV2 為DNA 病毒，而CSFV 和PRRSV 為RNA 病毒，因此必須選擇一種能夠同時用于檢測2 種核酸的技術，本研究中采用的是一步法RT-PCR 技術，能夠直接對樣本中RNA 進行檢測，同時又不會影響樣本中的DNA 檢測，因此可以大大縮短檢測時間和提高檢測的準確性。多重熒光定量PCR 是在普通熒光PCR 基礎上衍生出來的一項新技術，它可以在一個反應管中同時檢測多種目的基因。與傳統熒光PCR 方法相比，具有系統、高效和經濟簡便等優點，因此被廣泛用于動物疾病的檢測、臨床和食品安全檢測等領域[15-16]。本研究中使用的Applied Biosystems 7500 檢測平臺可以同時分辨出5 種不同熒光信號，結合熒光PCR 儀通道的設計特點，CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 探針分別用熒光信號強度較高且干擾較小的FAM、HEX、CY5 和Texas Red 報告熒光分子標記以建立多重熒光定量RT-PCR 檢測方法。國內外尚未見有關于熒光定量PCR 方法同時檢測CSFV、PRV、PRRSV 和PCV2 4 種病毒的研究報道。為此本研究建立了一種可以用于同時鑒別診斷4 種主要的豬繁殖障礙性病毒的檢測方法，具有重要的意義。

應用所建立的方法對59 份疑似繁殖障礙癥狀的樣本進行了檢測，結果顯示，上述4 種病毒在豬群中均有發生，但單一感染某一種病毒的樣本較少，多數為同時感染2 種或3 種上述病毒，未見有4 種病毒同時感染的病例，表明此次所調研豬場內的繁殖障礙性疾病主要是由混合感染所致。本研究中發現PCV2 和PRRSV 存在較強的關聯性及同時發生的關系，CSFV 和PRV 無同時發生的相關性，這可能與豬場內CSFV 和PRV 發病率低有關。綜上所述，豬群中混合感染現象比較普遍。本研究建立的熒光定量PCR 方法為臨床常見的4 種豬繁殖障礙病的檢測提供了一種可行的方法，由于本次所收集的臨床標本數量有限，后期還將會對更多的臨床樣品進行驗證，進一步完善本方法的臨床應用。

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