3種魚類彈狀病毒熒光定量環介導等溫擴增檢測方法的建立

陳珍容，陳進會，陳 洵，唐大運，石 磊，顏其貴*

(1.四川農業大學動物醫學學院，四川溫江 611130；2.東莞出入境檢驗檢疫局，廣東東莞 523072；3.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東廣州 510012)

魚類彈狀病毒(Fish rhabdovirus)是一類引起魚及其他水生動物致死性和流行性病害的重要病毒病原。迄今報道的魚類彈狀病毒已有十幾種，目前最主要的、危害最大的幾種分別為鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、病毒性出血敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicemia virus,VHSV)、傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)等。SVCV 常在鯉科魚特別是在鯉魚中流行，主要導致鯉魚科魚類大規模暴發鯉春病毒血癥[1]。VHSV 是一種能夠感染各種年齡鮭鱒魚和各種海魚的致死性的、全身性傳染病病毒，引發病毒性出血性敗血癥[2]。IHNV 是引發傳染性造血器官壞死病的病原，主要感染鮭、鱒魚類。這3 種病毒引起淡、海水養殖的多種經濟魚類發生流行性病害，給世界水產養殖業造成嚴重的經濟損失，目前尚缺乏有效控制方法[3-4]。

對這3 種病毒通常采用RT-PCR 方法檢測；也有采用傳統環介導等溫擴增(LAMP)方法進行肉眼觀察檢測，本研究分別建立了這3 種魚類彈狀病毒的RT-LAMP 快速檢測方法，結合恒溫熒光檢測儀Deaou-308C，可以通過收集熒光信號來判斷樣品是否發生擴增并進行結果判讀，操作簡便，特異性和敏感性高，廣泛適應于基層現場檢測及大規模魚病監測。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實驗動物 SVCV、VHSV 和IHNV均由迪澳生物科技有限公司保存；傳染性胰壞死病毒(IPNV)核酸由北京出入境檢驗檢疫局張利鋒惠贈；狗魚彈狀病毒(PFRV)核酸、牙鲆彈狀病毒(HRV)核酸由深圳出入境檢驗檢疫局國家水生動物疫病檢測重點實驗室提供。斑馬魚購自東莞某出口觀賞魚養殖場。

1.2 主要試劑及儀器 AMV 反轉錄酶購自TaKaRa公司；病毒RNA 提取試劑盒、瓊脂糖DNA 回收試劑盒以及質粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Bst DNA polymerase large fragment 購自NEB 公司；SYBR Green I 熒光染料購自北京鼎國生物工程公司；SVCV 熒光RT-PCR 檢測試劑盒、VHSV 熒光RT-PCR 檢測試劑盒、IHNV 熒光RT-PCR檢測試劑盒均購自北京海森通生物科技有限公司；RT-LAMP、RT-PCR 引物由TaKaRa 公司合成。恒溫熒光檢測儀Deaou-308C 為廣州迪澳生物科技有限公司產品；熒光PCR 儀7500 為美國ABI 公司產品。

1.3 引物的篩選 參照文獻[3-5]的設計，篩選出擴增SVCV-1、VHSV-2 及IHNV-3 效率最優的引物(表1)。

表1 3 種彈狀病毒的引物序列Tabel 1 RT-LAMP primer sequences used in the study

1.4 病毒RNA的提取 IHNV、SVCV、VHSV 為RNA 病毒，按照病毒RNA 提取試劑盒說明書提取病毒RNA。使用UV-1800 DNA/RNA 濃度測定儀測定樣品A260nm/A280nm比值，計算RNA 濃度。按下列公式計算其濃度：RNA 原液濃度(ng/μL)=OD260nm×稀釋倍數×40，根據濃度計算其拷貝數[6]。

拷貝數(拷貝/μL)=[6×1023(拷貝/μL)×RNA 濃度(g/μL)]/[質量MW(g/mol)]

MW=RNA 堿基數(bp)×330 daltons/bp

1.5 RT-LAMP檢測條件的優化及方法的建立RT-LAMP 擴增初步按如下體系進行：FIP 和BIP 各1.6 μmol/L，F3 和B3 各0.2 μmol/L，20 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10 mmol/L KCl，8 mmol/L MgSO4，10 mmol/L(NH4)2SO4，10 mL/L Tween20，1 mol/L 甜菜堿，1.6 mmol/L dNTP，8 U Bst 大片段DNA 聚合酶，2 U AMV，0.5×SYBR Green I 1 μL，2 μL RNA，ddH2O 補足體積到25 μL。采用經過篩選的LAMP引物，對Mg2+、dNTP、Bst 大片段DNA 聚合酶、反應溫度和反應時間進行優化，以建立RT-LAMP的檢測方法。

采用方陣法分別對Mg2+濃度(0 mmol/L～10 mmol/L)、dNTP 濃度(1.0 mol/L～1.8 mol/L)、Bst 大片段DNA 聚合酶[0.5 μL(4 U)、1.0 μL(8 U)、1.5 μL(12 U)]、反應溫度(57 ℃、60 ℃、63 ℃、66 ℃、69 ℃)及反應時間(20 min～60 min)進行優化。

1.6 特異性試驗 分別提取SVCV、VHSV、IHNV以及HRV、PFRV、IPNV 的RNA 2 μL 作為特異性反應的模板，設無模板陰性對照，采用建立的3 種魚類彈狀病毒LAMP 檢測方法進行RT-LAMP 反應，于63 ℃運行40 min，驗證其特異性，利用恒溫熒光檢測儀Deaou-308C 觀察反應結果。

1.7 靈敏度試驗 采用病毒RNA 提取試劑盒提取病毒RNA，將提取后的模板進行定量后，分別進行10 倍梯度稀釋，每個稀釋度取2 μL 進行RT-LAMP，以100 倍稀釋的病毒RNA 模板作為陽性對照，設無模板陰性對照，在恒溫熒光檢測儀Deaou-308C 上進行RT-LAMP，63 ℃運行40 min 以確定靈敏度。

以同樣稀釋度的RNA 作為一步法RT-PCR 模板，參照試劑盒要求的模板、引物和反應體系，在ABI 7500 熒光定量PCR 儀上進行試驗。25 μL 反應體系包括：RT-PCR 反應液15 μL，酶混合物1.0 μL，RNA 模板9.0 μL，反應程序：反轉錄42 ℃30 min；92 ℃3 min；92 ℃15 s、53 ℃15 s、60 ℃30 s，40 個循環；在第3 階段每次循環的60 ℃退火延伸時收集熒光，根據熒光曲線和Ct 值判斷結果。

1.8 人工感染試驗

1.8.1 接種試驗 取24 條健康正常的斑馬魚，隨機平均分為3 個人工感染組和一個陰性對照組，每組6 條。適應性飼養2 d 后，分別向3 個感染組中投入SVCV、VHSV 和IHNV 病毒懸液，使其濃度維持106TCID50左右，3 d 后，每個感染組的斑馬魚再進行腹腔注射108TCID50左右的病毒懸液20 μL進行強化，繼續飼養3 d 后，取每條魚的內臟和腦組織。

1.8.2 斑馬魚樣品檢測 取斑馬魚組織臟器(內臟及腦)2 g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加5 mL PBS 混勻，2 000 r/min 離心10 min 取上清轉入無菌離心管中，采用病毒RNA 提取試劑盒提取RNA。分別利用本研究的SVCV、VHSV、IHNV 引物，在恒溫熒光檢測儀Deaou-308C 上進行檢測。

同時采用熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒進行檢測，比較檢測結果。

2 結果

2.1 RNA模板濃度 經測定，SVCV RNA 的濃度為2.4 ng/μL(約4.0×109拷貝/μL)；VHSV RNA 的濃度為4.5×10-2ng/μL(約5.4×107拷貝/μL)；IHNV RNA 的濃度為0.36 ng/μL(約4.3×108拷貝/μL)。

2.2 反應體系的優化 經反應條件的優化，確定Mg2+濃度在4 mmol/L～6 mmol/L；dNTP 濃度為1.4 mmol/L～1.6 mmol/L；Bst 大片段DNA 聚合酶至少為1 μL(8 U)；反應時間為40 min；反應溫度為63 ℃。將混合物放置于恒溫熒光檢測儀Deaou-308C 反應孔中，63 ℃恒溫反應40 min 進行檢測。

2.3 特異性試驗 分別提取SVCV、VHSV、IHNV以及HRV、PFRV、IPNV RNA 2 μL 作為特異性反應的模板，采用初步組裝的3 種魚類彈狀病毒LAMP 檢測試劑盒進行RT-LAMP 反應。結果顯示，僅SVCV RNA 模板組、VHSV RNA 模板組、IHNV RNA 模板組發生特異性擴增，HRV、PFRV、IPNV及陰性對照未出現擴增(圖1)，表明建立的3 種魚類彈狀病毒LAMP 檢測方法的引物針對SVCV、VHSV、IHNV 具有良好的特異性。

圖1 RT-LAMP 引物特異性反應Fig.1 RT-LAMP Primer specificity

2.4 靈敏度試驗 將拷貝數為4.0×109拷貝/μL SVCV RNA、5.4×107拷貝/μL VHSV RNA、4.3×108拷貝/μL IHNV RNA 進行100～10-6稀釋，每個濃度梯度分別取2 μL 進行RT-LAMP 擴增，63 ℃運行40 min(圖2A、2C、2E)。同時利用熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒對同樣的模板進行檢測(圖2B、2D、2F)。

結果表明，各10 倍系列稀釋模板出峰時間逐步延后，RT-LAMP 和熒光定量RT-PCR 均能夠檢測到10-5SVCV、10-3VHSV、10-4IHNV，即拷貝數分別為4.0×104拷貝/μL、5.4×104拷貝/μL、4.3×104拷貝/μL(圖2)，表明RT-LAMP 與熒光定量RT-PCR 的靈敏度一致。

圖2 RT-LAMP 靈敏度試驗Fig.2 The sensitivity test of RT-LAMP

2.5 人工感染樣品檢測結果 采用本研究建立的檢測方法在恒溫熒光檢測儀Deaou-308C 恒溫反應檢測24 個樣品，同時與SVCV RT-PCR 檢測試劑盒、VHSV RT-PCR 檢測試劑盒、IHNV RT-PCR 檢測試劑盒的檢測24 個樣品結果的比較(表2)。結果表明，本研究初步組裝的RT-LAMP 檢測試劑盒與市售的一步法RT-PCR 試劑盒在檢測人工感染的斑馬魚樣品結果上并無差異，同時也表明3 種病毒引物間無交叉反應的現象。

表2 臨床樣品檢測結果的比較Table 2 The comparison of clinical samples test results

3 討論

2010 年Lucchi 等首次報道了利用德國QIAGEN公司生產的ESE-Quant tube scanner 系統進行LAMP擴增的數據采集，并且將該方法用于瘧疾的快速檢測[7]。本研究中熒光定量PCR 靈敏性強，高于普通PCR 100 倍[8]，但由于設備和技術的要求很高，很難普及使用，而國內廣州迪澳生物科技有限公司自主研發的國內首臺恒溫熒光檢測儀Deaou-308C，該儀器具有輕便易攜帶，操作簡單方便的特點，十分適用于現場快速檢測和基層推廣，以及進出口口岸檢疫部門的疫病監測。本研究采用全程閉管檢測，避免了傳統LAMP 反應因開蓋導致的核酸擴增的氣溶膠污染，杜絕了假陽性結果的產生。

本研究建立的恒溫熒光定量RT-LAMP 反應體系包括一對內引物(FIP、BIP)、一對外引物(F3、B3)以及一對環引物(LOOPF、LOOPB)，環狀引物通過與莖環結構雜交，啟動鏈置換DNA 的合成，環狀引物結合的區域在啞鈴狀結構的5' 端的成環區即F2 和F1 之間(或B2 和B1 之間)，這樣，所有的莖環DNA 或者與內引物結合，或者與環狀引物雜交結合，從而把反應時間縮短到15 min 以內即可辨別陰陽性，表明熒光檢測比濁度檢測更為靈敏快捷。特異性試驗結果顯示，親緣較近的SVCV、VHSV和IHNV 之間無交叉反應，并且與親緣較遠的彈狀病毒HRV、PFRV、IPNV 也無交叉反應，表明篩選的引物特異性較好，能夠滿足檢測需求。靈敏度試驗結果顯示，能夠檢測到3 種彈狀病毒模板濃度拷貝數分別為4.0×104拷貝/μL、5.4×104拷貝/μL、4.3×104拷貝/μL，表明該方法的靈敏度較高。

近年來，隨著LAMP 檢測技術深入研究，應用領域越來越廣泛，人類疾病的快速檢測，動植物檢疫和食品安全檢測廣泛使用該技術[9-10]。相對于大多數研究者實光LAMP 檢測方法采用濁度儀，史秀杰等利用GENIE Ⅱ熒光擴增儀建立的傳染性鮭魚貧血癥病毒實時熒光RT-LAMP 檢測方法，能夠檢測出78.4 fg RNA，比常規RT-PCR 靈敏度高100 倍，更為便捷[11]。姜侃等建立了3 重LAMP 方法檢測食品中沙門氏菌、單增李氏特菌和葡萄球菌，達到了LAMP 一次檢測多種病原高通量更為省時的檢測方法[12]。本研究之初，也試圖建立3 重RT-LAMP 一次檢測3 種魚類彈狀病毒的高通量方法，考慮到一種病毒就需要3 對引物，3 種病毒引物間的干擾問題，同時恒溫熒光檢測儀Deaou-308C 實時熒光檢測平臺，無法達到多道熒光檢測的要求，需要繼續改進和深入研究。

3 種魚類彈狀病毒快速LAMP 檢測方法的建立，為基層動檢和實驗室現場檢測，特別是口岸鮮活魚類快速通關檢測提供了良好的技術手段。

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