QuEChERS法結合高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜測定食用貝類產品中4種脂溶性貝類毒素

曾廣豐,劉 青，*,王志元,丁 博,陳文銳,韋曉群,李文斌,胡志玲,韓 深

(1.廣東出入境檢驗檢疫局技術中心,廣東廣州 510623;2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623;3.迪馬科技有限公司,北京 100029;4.北京出入境檢驗檢疫局技術中心,北京 100026)

QuEChERS法結合高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜測定食用貝類產品中4種脂溶性貝類毒素

曾廣豐1,2,劉 青1,2，*,王志元1,2,丁 博1,2,陳文銳1,2,韋曉群1,2,李文斌3,胡志玲3,韓 深4

(1.廣東出入境檢驗檢疫局技術中心,廣東廣州 510623;2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623;3.迪馬科技有限公司,北京 100029;4.北京出入境檢驗檢疫局技術中心,北京 100026)

建立了QuEChERS凈化技術結合高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜法測定食用貝類產品中4種脂溶性貝類毒素(Okadaic Acid,OA、Spirolides1,SPX1、Dinophysistoxin1,DTX1、Azaspiracid1,AZA1)的快速方法。以QuEChERS凈化技術對食用貝類樣品進行提取與凈化后,經C18色譜柱分離,用高分辨飛行時間質譜儀(ESI源)進行測定。用PeakView 軟件對分析結果進行全智能分析,對照每個樣品與標準品的TOF-MS質量精度及同位素分布情況、保留時間以及TOF-MS/MS譜圖,對化合物作出定性判斷。同時利用MultiQuant軟件對四種毒素進行外標法定量,OA和DTX1的線性范圍為2.0～100 μg/L,方法檢出限為10 μg/kg;AZA1和SPX1的線性范圍為0.5～20 μg/L,方法檢出限為2.0 μg/kg,相關系數(R2)均大于0.997。高、中、低三個添加水平的平均回收率在75.6%～94.1%之間,RSD小于10%。應用該方法對進出口的貽貝、北極貝、象拔蚌、牡蠣等20個樣品進行檢測,發現8個樣品的SPX1和2個AZA1測定結果為陽性。該方法操作簡便、高效快速、靈敏度高、重現性好,適用于貝類產品中脂溶性貝類毒素的檢測。

高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜,QuEChERS,脂溶性貝類毒素,食用貝類產品

貝類毒素特指主要由海洋有毒微藻或微生物產生,能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的、對其他生物包括人類產生危害的一大類小分子有毒化合物[1]。貝類毒素毒性大、反應快、且無適宜解毒劑,具有突發性和廣泛性,故水產品的安全問題直接關系到消費者的身體健康和生命安全[2]。常見的脂溶性貝毒有軟骨藻酸(DA)、大田軟海綿酸毒素(OA)及其類似物、原多甲藻酸毒素(AZA)、蝦夷扇貝毒素(YTX)、大環內酯類扇貝毒素(PTX)、鰭藻毒素(DTX)和螺環內酯毒素(SPX)等。歐洲食品安全局對貝肉中部分毒素的安全限量為:OA、PTX和AZA均為160 μg/kg;YTX 1.0 mg/kg,SPX等環亞胺類毒素和DTX等鰭藻毒素還未設定安全限量[3]。

當前貝類毒素的檢測方法主要有小鼠生物分析法(MBA法)[4]、細胞毒性測試法[5]、酶蛋白抑制法[6]、免疫分析法[7]、液相色譜-串聯質譜法[8]。MBA法檢測周期長,易受到其他內源性化合物影響出現假陽性結果;細胞毒性測試法需要使用的細胞容易在實驗過程中大面積死亡,使該方法重現性差,不易推廣使用;酶蛋白抑制法對蛋白磷酸酶要求極高,必須保證其活性良好,且該法無法提供相關貝類毒素信息;免疫分析法檢測較為快捷,但容易對一些主要衍生物有交叉反應或者反應不靈敏;歐盟于2012年提出將液相色譜-串聯質譜法作為貝毒測定的參考方法(EN 16204-2012)[9-10]。但該法的建立必須依賴標準物質對儀器條件進行優化,在多殘留檢測和未知物的分析測定應用中受到限制。高分辨飛行時間質譜儀具有高分辨率和高靈敏度,可實現高通量的目標物或非目標物篩選以及高可靠性的確證定量分析。QuEChERS凈化技術是一種通用性較強、快速簡便的前處理方法,現已廣泛用于食品污染物的檢測[11-12]。本文使用QuEChERS凈化技術結合液相色譜-高分辨飛行時間質譜檢測技術對貝類產品中OA、DTX1、SPX1和AZA1進行測定。與低分辨率質譜相比,高分辨質譜一級全掃描和數據依賴掃描進行檢測分析,降低了假陽性結果出現的可能性,使檢測結果更加準確。本方法靈敏度高、專屬性強,可實現高通量的脂溶性貝類毒素篩選以及高可靠性的確證定量分析,滿足日常貝類產品中脂溶性貝類毒素監控的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四種脂溶性貝類毒素標準品:OA(18.1±1.9)μg/g、DTX1(19.2±1.4)μg/g、SPX1(8.9±0.4)μg/g和AZA1(1.57±0.09)μg/g 0.5 mL甲醇儲備液,購自加拿大海洋生物科學研究所(NRC);乙腈、乙酸銨、甲酸(色譜純,美國Fisher公司);無水硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈉(NaCl)、檸檬酸鈉(TSCD)、檸檬酸氫二鈉(DHS)、C18、PSA dSPE分散劑(分析純,迪馬科技公司);微孔濾膜(0.22 μm,津騰公司);微纖維濾紙(美國Vicam公司);實驗用水為經Milli-Q純水系統制得的超純水(電阻率為18.2 MΩ)。

高分辨飛行時間質譜儀 Triple TOF 5600+,美國AB公司;高效液相色譜儀 LC-20AD,日本島津公司;Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm) 美國菲羅門公司;氮吹濃縮儀(Turbo Vap@LV,瑞典Biotage公司);高速均質機 T25,德國IKA公司;離心機 4k-15,美國Sigma公司;旋渦混勻器VORTEX 4 德國IKA公司;Milli-Q超純水裝置 美國Millipore公司。

1.2 色譜-質譜條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm);進樣體積:5 μL;流速:500 μL/min(ESI+),300 μL/min(ESI-);柱溫:40 ℃;流動相:A-乙腈;B-水(含2 mmol/L醋酸銨,0.1%甲酸),洗脫條件如表1所示。

表1 ESI模式下液相色譜洗脫條件

1.2.2 質譜條件 掃描方式:正/負離子掃描,一級(TOF)掃描質量范圍(m/z):100～1000;二級(Product ion)掃描質量范圍(m/z):50～1000;動態背景扣除:開;IDA閾值:100 cps。實驗中選擇電噴霧離子源(ESI)作為檢測離子源,大氣壓化學電離源(APCI)作為校正離子源。正離子模式校正液流速為0.3 mL/min;負離子模式校正液流速為0.5 mL/min。通過自動校正系統,每5個樣品進行一次自動校正,以確保系統在批內的精準質量數穩定。質譜參數詳見表2。

表2 TOF-IDA-MS模式質譜參數

表3 四種貝類毒素標準品信息

1.3 樣品前處理

試樣制備:由于貝類毒素在貝類產品中分布不勻,內臟部分富集較多,貝肉含量較少,因此在取樣時,應取去除外殼的整體作為分析試樣,以確保樣品的均一性和代表性。樣品洗凈瀝干后稱取約300 g于潔凈的密樣品中,放入-18 ℃的冰箱中密封保存,制樣與儲存過程中要避免樣品間交叉污染。

提取和凈化:準確稱取制備好的試樣10 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,分別加入25 mL 85%乙腈-水提取液,4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉,20000 r/min轉速下均質60 s,用微纖維濾紙過濾,取10 mL濾液至離心管中,加入150 mg C18、150 mg PSA、dSPE凈化劑和1 g無水硫酸鎂,漩渦振蕩2 min,在8000 r/min轉速下離心5 min,取5 mL上清液移至試管中,40 ℃下氮氣吹至近干,以1 mL 85%乙腈水溶液重新溶解,漩渦振蕩60 s,過0.22 μm微孔濾膜,待儀器分析測定。

1.4 標準溶液配制

四種貝類毒素的標準儲備液,于-18 ℃條件下保存,保存期為6個月;配制標準工作曲線時,使用凈化好的空白基質液根據要求將儲備液稀釋成不同濃度,于4 ℃條件下保存,工作曲線現用現配,有效期2周。四種貝類毒素標準的信息見表3。

2 結果與討論

2.1 提取方法優化

2.1.1 提取溶劑的選擇 四種貝類毒素易溶于甲醇、乙腈,丙酮等有機溶劑。實驗選取北極貝樣品,加標量為10 μg/kg,超聲提取,分別考查了乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈四種溶劑的提取效果。結果表明,乙腈對四種貝類毒素的提取效果較好?？紤]到使用純乙腈進行提取時,樣品中富含的蛋白質、脂肪、氨基酸等會增加提取液中干擾雜質的含量,因此在比較了不同比例乙腈-水溶液的提取效果后,確定提取溶劑為85%的乙腈-水溶液。不同溶劑對AZA1提取率的影響見圖1。

圖1 不同溶劑對AZA1提取率的影響Fig.1 AZA1 extraction efficience of different solvent

2.1.2 提取方式的選擇 比較了振蕩30 min、均質1 min、室溫超聲20 min三種提取方式。選取北極貝樣品,加標量為10 μg/kg,均質提取回收率為82.3%,振蕩提取回收率為51.7%,超聲提取回收率為64.3%。故選取均質提取方式。

2.1.3 提取溫度和時間的優化 對不同的提取時間和溫度對提取效果的影響進行了實驗,結果表明至少60 s才能夠保證目標化合物的提取效率;在室溫、40、50、60、70 ℃下,目標化合物的提取效果并無明顯差異。故選取在室溫條件下,以85%乙腈-水溶液作為提取液,采用高速均質機將樣品均質60 s。

2.1.4 凈化條件的選擇 色譜分析常見的凈化方式有液液萃取、固相萃取、免疫親和萃取等,本文采用了基質固相分散萃取(DSPE)技術進行凈化處理,分析比較了Florisil、C18、PSA、GCB等幾種常用凈化劑的凈化效果,通過優化最終確定了使用C18和PSA凈化劑。針對常見的四種貝類產品牡蠣、象拔蚌、北極貝和貽貝的提取,對分散劑和鹽的用量進行了實驗。實驗分別考察了無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉的加入量對提取效率的影響。結果表明,4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉的加入即能夠獲得較好的提取效率。在最優組合條件下,以北極貝為基質加標10 μg/kg,四種貝類毒素的回收率分別為:OA,76.1%;SPX1,90.6%;DTX1,77.8%;AZA1,87.9%。

2.2 色譜條件的優化

實驗考察了乙腈-水和甲醇-水兩種體系作為流動相時四種貝類毒素的色譜保留行為。結果表明,使用甲醇-水體系作為流動相時,甲醇溶劑體系要將目標化合物洗脫下來所需時間為13 min。而乙腈的洗脫能力較強,所需分析時間縮短,能夠提高工作效率。DTX1和OA 10 min即可完成基線分離,AZA1和SPX1 8 min完成基線分離,且峰形尖銳、對稱,如圖2所示。

圖2 四種貝類毒素的提取色譜圖Fig.2 Chramotogram of four shellfish toxins

2.3 質譜條件的確定

2.3.1 去簇電壓的確定 去簇電壓(Declustering Potential,DP)直接影響目標化合物的檢測靈敏度。優化DP是為了保證一級譜圖中準分子離子的傳輸效率最高,產生碎片離子最少。增大DP,準分子離子峰豐度增大,但豐度達到最大值后繼續增大DP,會導致目標化合物在源內裂解,導致離子碎片增多,準分子離子峰豐度下降。本實驗考察了60～150 V和-60～-150 V去簇電壓的影響,結果表明,正離子模式在100 V,負離子模式在-100 V的DP下,目標化合物能夠得到豐度最高的準分子離子峰。

2.3.2 碰撞能量的確定 碰撞能量(Collision Energy,CE)直接影響目標化合物二級譜圖信息的豐富程度。碰撞能量低,準分子離子的響應強度高,但得到的碎片信息少。增大碰撞能量,會導致準分子離子的響應逐漸減弱,碎片離子增多。本實驗考察了20～95 eV和-20～-95 eV碰撞電壓的影響。為得到信息全面的MS/MS譜圖,本實驗選取三張不同CE值采集的譜圖進行疊加,作為最終的MS/MS譜圖。正離子模式的CE值為40、55、70 eV;負離子模式的CE值為-65、-80、-95 eV。

2.3.3 質譜工作流程優化 利用優化完的DP、CE建立TOF-IDA-MS的工作流程,進行目標物測定。一次進樣即可同時獲得定性和定量數據。將一級高分辨母離子實測值與理論值進行對照,見表4。IDA閾值設為100 cps,豐度大于該設定值即采集MS2譜圖。利用系統的自帶的動態背景扣除(DBS)功能,可極大降低本底背景的二級質譜信號干擾,以提高樣品中目標物的MS2信號。本研究采用電噴霧離子源正/負離子掃描模式,通過總離子流掃描可以看出,4種脂溶性貝類毒素形成的準分子離子峰中AZA1和SPX1[M+H]+峰豐度最高,OA和DTX1[M-H]-峰豐度最高。

表5 貽貝中四種貝類毒素的線性范圍、線性方程、相關系數和檢測限

表4 四種貝類毒素的質譜分析參數

2.3.4 目標化合物確定 參考歐盟農藥殘留分析質量控制程序提出的化合物結構確證要求,高分辨質譜儀僅需要一個高分辨母離子和一個高分辨子離子就可以滿足對目標化合物的確證要求[13]。在本研究中,我們將全掃描模式的母離子作為定量離子,將豐度最高的IDA數據依賴性掃描碎片離子作為定性離子,見圖3。四種脂溶性貝類毒素豐度最高的碎片離子分別為,AZA1(m/z):824.4882,由母離子脫掉一個水分子形成[C47H70NO11]+;SPX1(m/z):674.4384,由母離子脫掉一個水分子形成[C42H60NO6]+;DTX1(m/z):255.1239,[C13H19NO5]-;OA(m/z):255.1235,[C13H19NO5]-。

圖3 四種貝類毒素的二級質譜圖Fig.3 MS2 fragmentation of four shellfish toxins

2.4 方法學評價

2.4.1 線性范圍和檢出限 利用系統自帶的MultiQuant軟件對四種貝類毒素采用外標法進行定量。結果表明,SPX1和AZA1在0.5～20 μg/L的濃度范圍內線性較好,OA和DTX1在2.0～100 μg/L的濃度范圍內線性較好。以濃度為橫坐標(x,μg/L),峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸計算,所得相關系數(R2)均大于0.997。根據3倍信噪比(S/N)確定化合物的方法檢出限。樣品中OA和DTX1的方法檢出限均為10 μg/kg,AZA1和SPX1的方法檢出限為2.0 μg/kg。詳見表5。

2.4.2 方法重現性 實驗選取北極貝樣品進行添加實驗,添加量為10 μg/kg,考察了方法一日內的重現性和日間的重現性,實驗結果表明,方法的日內和日間重現性較好,相對標準偏差小于10%(n=6),詳見表6。

2.4.3 精密度和回收率 分別對空白貽貝進行三個水平的加標實驗,每個水平平行測定6次,計算回收率及相對標準偏差。選取純水代替試樣,按照上述步驟進行空白實驗。四種毒素在三個水平的添加回收率范圍均在75.6%～94.1%之間,RSD均小于10%(n=6),滿足分析的要求,詳見表7。

表6 方法的日內和日間重現性(n=6)

表7 貽貝基質中四種貝類毒素的回收率和精密度實驗結果(n=6)

2.5 實際樣品測定

采用已建立的方法,對在廣東局轄區口岸提供的北極貝、牡蠣、象拔蚌和貽貝共20份樣品進行四種貝類毒素的本底測定,發現8個陽性樣品,其中8個為SPX1檢出,含量在18.1～55.3 μg/kg之間;其中2個同時有AZA1檢出,含量在3.5～6.6 μg/kg之間,均低于歐盟限量要求。

3 結論

本方法采用QuEChERS 凈化技術結合高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜法快速測定食用貝類產品中4種脂溶性貝類毒素軟海綿酸(OA)、原多甲藻酸(AZA1)、鰭藻毒素(DTX1)、螺環內酯毒素(SPX1)。高分辨質譜與QuEChERS 凈化技術相結合,靈敏度高,操作簡便,能有效去除基質中的各種干擾雜質。方法線性良好,回收率、精密度均能滿足進出口貝類產品中脂溶性貝類毒素分析的需要。本方法的建立將有助于認識受污染貝類的脂溶性毒素組分,提高對相關貝類毒素的分析能力,對于保障水產安全以及消費者的人身健康具有重要的現實意義。

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Determination of four lipophilic shellfish toxins in edible shellfishes by QuEChERS technology combined with high performance liquid chromatography-high resolution time of flight mass spectrometry

ZENG Guang-feng1,2,LIU Qing1,2,*,WANG Zhi-yuan1,2,DING Bo1,2,CHEN Wen-rui1,2,WEI Xiao-qun1,2,LI Wen-bin3,HU Zhi-ling3,HAN Shen4

(1.Inspection & Quarantine Technology Center of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China;2. Guangdong Key Laboratory of Import and Export Technical Measures of Animal,Plant and Food,Guangzhou 510623,China;3.Dikma Technology Ltd.,Beijing 100029,China;4.Inspection & Quarantine Technology Center of Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 100026,China)

A determination method of four lipophilic shellfish toxins(Okadaic Acid,OA;Spirolides1,SPX1;Dinophysistoxin1,DTX1;Azaspiracid1,AZA1)in edible shellfish products by QuEChERS technology combined with high performance liquid chromatography-high resolution time of flight mass spectrometry(HPLC-TOF-MS/MS)was established. QuEChERS technology was used to extract and purify the samples. Four lipophilic shellfish toxins were separated by C18column and detected by HPLC-TOF-MS/MS at electrospray ionization(ESI)mode. After importing data by PeakView software,TOF-MS/MS quality precision,isotopic distribution and retention time of each compounds,as well as the MS2chromatogram of the standard solution and sample were compared to qualitatively analyze the target compound. Finally,the software of MultiQuant was used to quantify by external standard calibration method.The calibration curves of OA and DTX1 showed good linearity in the range of 2.0～100 μg/L,the limits of detection(LOD,S/N=3)were 10 μg/kg,while the LOD of AZA1and SPX1 were 2.0 μg/kg,the ranges were between 0.5～20 μg/L.The correlation coefficients(R2)were all above 0.997.The average spiked recoveries of four shellfish toxins at three concentration levels were between 75.6%～94.1%,and RSD all below 10%. 20 import & export samples including mussel,octopus,geoduck and oyster were screened by the developed method,SPX1 was found in 8 samples and AZA1 in 2 samples. The developed method was easy,quick,sensitive,reproducible and suitable for the determination of lipophilic shellfish toxins in shellfish products.

high performance liquid chromatography-high resolution time of flight mass spectrometry;QuEChERS;lipophilic shellfish toxins;edible shellfish products

2015-03-23

曾廣豐(1988-)，男，本科，助理工程師，研究方向：食品安全與檢測，E-mail:zgf621@126.com。

*通訊作者:劉青(1971-)，女，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全與檢測,E-mail:liuq@iqtc.cn。

廣東檢驗檢疫局科技計劃項目(2012GDK38);國家質檢總局科技計劃項目(2011k193)。

TS254.4

A

1002-0306(2015)21-0289-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.051