食品中亞致死損傷單增李斯特菌的研究進展

宣曉婷，丁 甜*，劉東紅

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

食品中亞致死損傷單增李斯特菌的研究進展

宣曉婷，丁 甜*，劉東紅

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一類人畜共患的食源性致病菌。食品加工過程中所產生的亞致死損傷單增李斯特菌是不容忽視的，在適宜的環境下，損傷菌會恢復至正常狀態繼續生長，對消費者的健康造成威脅，因此亞致死損傷菌的存在是食品安全的一大隱患。探究亞致死損傷菌的檢測、修復是目前研究的熱點之一，本文將綜合相關研究對近年來食品中亞致死損傷單增李斯特菌的檢測、修復方法以及發展趨勢進行綜述。

亞致死損傷；單核細胞增生李斯特菌；檢測；修復；發展趨勢

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）簡稱“單增李斯特菌”，是一種廣泛分布于自然界的人畜共患食源性致病菌，它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多，特別對孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人危害嚴重。2011年美國暴發了10多年來最嚴重的一起食源性疾病事件，由于食用污染了單增李斯特菌的香瓜導致21 人死亡，其中受感染的人群中多為老年人、懷孕婦女以及免疫功能低下者。2012年8月美國再現甜瓜染菌事件，造成2 人死亡。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一［1］。

研究表明，在食品加工過程中，通過加熱、冷凍、干燥、輻射、高靜水壓、發酵、加抗菌藥物等方法處理食品后，食源性致病菌會出現3 種生理狀態不同的細胞：正常的細胞、處于亞致死損傷狀態的細胞和死亡細胞［2］。1951年Hartsell［3］最先將亞致死菌定義為在營養豐富的非選擇性培養基上能生長，而選擇性培養基上無法產生可見菌落的微生物存在狀態。而細菌在非選擇性培養基和選擇性培養基上的菌落數的差值，即為該菌處于亞致死狀態的數目［4］。在實際的生產與流通過程中，由于技術上的缺陷、人為的操作不當以及殺菌處理對產品質量的影響等因素，產品中的致病菌并未被完全殺死而是處于亞致死狀態，普通檢測致病菌的方法并不能檢測出亞致死狀態致病菌，而在產品貯藏、運輸等過程中，一旦處于亞致死狀態的致病菌處于適宜的環境條件下，亞致死菌能夠自我修復并且恢復到正常的狀態，因此處于亞致死損傷狀態的細菌可能導致食品二次污染，一旦進入人體便會存在潛在危害，給食品安全保障帶來嚴重隱患。

目前亞致死損傷菌的檢測成為了食品安全檢測的熱點和難點之一［5］，本文綜合大量的文獻數據，對其進行歸整和分析，對亞致死損傷單增李斯特菌的檢測和修復方法進行研究，并對檢測和修復技術的發展趨勢作一綜述。

1　食品中的處理方式可以引起單增李斯特菌亞致死損傷

在食品工業中，為了防止食品腐敗變質、延長食品貨架期，食品的處理方式可以分為熱處理和非熱處理。就目前而言，在所有可利用的消毒滅菌方法中，熱力殺菌是一種應用最早、效果最可靠、使用最廣泛的方法，它可以殺滅大部分的微生物，包括細菌繁殖體、真菌、原蟲、藻類、病毒和抵抗力更強的細菌芽孢，熱力滅菌在工業消毒滅菌上深受重視。對于單增李斯特菌，Busch等［6］將其在56 ℃條件下處理50 min后，損傷率達到98.1%～99.9%，熱力殺菌對單增李斯特菌有較好的殺菌效果。

隨著生活水平的不斷提升，人們對食品的安全、營養、新鮮等要求越來越高，這就推動了非熱加工技術的研究開發［7］。目前新型的食品非熱殺菌技術有輻射、超臨界CO2系統［8］、高壓靜電場、脈沖電場（pulsed electric fields，PEF）、超聲波、電位水［9］、振蕩磁場（oscillating magnetic fields，OFM）等［10］，或將這些技術與一些化學試劑相結合［11］。不同的加工處理方法對單增李斯特菌的影響不同，國內外很多學者就加工處理方法和環境脅迫對單增李斯特菌的影響進行了研究［12］。Vicky等［13］研究致使單增李斯特菌、空腸彎曲菌和大腸桿菌O157亞致死的方法，研究發現單增李斯特菌對氧化應激更為敏感。Zhao Wei等［14］進行了脈沖電場（PEF）導致牛奶中金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌致死的研究，同時比較了脈沖電場強度對3 種菌的致損傷情況。當脈沖電場強度為30 kV/cm、處理時間為200 ?s時，單增李斯特菌亞致死損傷率達到最大值43.64%；而大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在脈沖電場強度為25 kV/cm、處理時間為200 ?s時亞致死損傷率達到最大值分別為40.74%和36.51%，之后隨著脈沖電場強度的增加，亞致死損傷率降低，實驗發現單增李斯特菌對PEF的抵抗能力是最強的。其中當脈沖電場強度為30 kV/cm、處理時間為200 ?s時，單增李斯特菌的亞致死率始終高于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，研究發現，單增李斯特菌對于惡劣的環境條件有更強的抵抗力，但更多的是以亞致死損傷菌的狀態生存，一旦環境條件適宜，亞致死狀態會自動修復到正常狀態，對食品安全產生了極大的威脅。

2　食品中單增李斯特菌亞致死檢測與修復

由于亞致死損傷單增李斯特菌的修復、再生長導致的食品安全問題更為嚴重，越來越多的研究者對亞致死損傷單增李斯特菌的檢測方法、修復再生長機理進行研究。

2.1食品中單增李斯特菌亞致死檢測方法

由于食品中可能存在亞致死狀態的單增李斯特菌，對于新型的檢測技術就要求能夠同時檢出活性細胞和損傷細胞。同時，大多數食品中單增李斯特菌的存在都是很低水平的，因此在檢測之前需要對食品中單增李斯特菌進行選擇性增菌培養。然而，目前常用的作為選擇性培養基的成分對損傷致病菌的修復和生長會產生抑制作用，因此在檢測之前，必須經過非選擇性培養基修復后再進行選擇性增菌［15］。非選擇性和選擇性培養法是檢測亞致死菌最常用的方法。非選擇性培養基既可以讓非目的菌生長，又可以使損傷的目的菌修復，而選擇性培養基只可以使非目的菌生長，細菌在非選擇性培養基和選擇性培養基上的菌落數的差值，即為該菌處于亞致死狀態的數目。檢測亞致死單增李斯特菌大多采用胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（trypticase soy-yeast extract agar，TSA-YE）作為非選擇性培養基，PALCAM瓊脂作為選擇性培養基［4］。單增李斯特菌的死亡率和亞致死損傷率是通過非選擇性培養基TSA-YE和選擇性培養基PALCAM的計數結果的差值來計算［16］，計算公式如下所示。

在食品加工過程中，高溫、冷凍、輻射、鹽分、抗生素、消毒劑等處理都有可能導致單增李斯特菌亞致死。Vicky［13］和Zhao Wei［14］等研究不同處理方式對單增李斯特菌所造成影響的差異，所采用的檢測方法都是非選擇性和選擇性培養法（表1）。在7 種應激狀態中，加酸、饑餓、過氧化和脈沖電場的應激都能產生較大的亞致死損傷率，其中加酸的處理方式導致單增李斯特菌亞致死損傷率達到最大值。堿和氯同樣會影響對單增李斯特菌的熱殺菌效果，Taormina等［17］研究發現單增李斯特菌在56 ℃、pH 12的胰蛋白磷酸肉湯中培養時其熱阻性比在pH 7.3時的熱阻性要強，實驗說明堿能提高單增李斯特菌的熱阻性，堿能中和致病菌所產生的酸，以防止pH值降低。單增李斯特菌在56 ℃、pH 7、含2.0 mg/L或2.4 mg/L游離氯的磷酸鉀緩沖液中菌落數減少1.3 （lg（CFU/mL）），而在56 ℃、pH 7、含有6 mg/L的游離氯的磷酸鉀緩沖液中菌落數減少4.02 （lg（CFU/mL）），由于氯對細菌會造成部分損傷，導致單增李斯特菌對熱更為敏感。

Rowan等［18］采用氧化還原熒光探針5-氰基-2，3-二甲苯基四氮唑氯化物（5-cyano-2，3-ditolyl tetrazolium chloride，CTC）對單增李斯特菌的呼吸細胞進行標記，對單增李斯特菌進行脈沖等離子體氣體放電（pulsed plasma gas discharge，PPGD）處理，導致單增李斯特菌亞致死率為46.8%。研究發現單增李斯特菌對PPGD有更強的抵抗力，但其亞致死比例相比于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌卻是最高的，此現象與Zhao Wei等［14］研究脈沖電場（PEF）對單增李斯特菌的亞致死的規律相同。Al-Qadiri等［19］采用傅里葉變換紅外光譜（fourier translation infrared spectroscopy，FT-IR）研究單增李斯特菌和血清型鼠傷寒沙門氏菌的熱損傷，此方法快速高效地檢測并區分出健康、亞致死和死亡致病菌。

表1　不同檢測方法檢測不同處理方式導致單增李斯特菌亞致死程度［13-14，17］Table1 Percentage of sub-lethal injury in L. monocytogenes subjected to different stresses［13-14，17］

此外，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術近年來也被廣泛地運用到食源性致病菌快速檢測中。常規PCR及其衍生出來的許多PCR技術廣泛地應用到單增李斯特菌檢測中。由于實際樣品中單增李斯特菌數量很少，這給檢測帶來了很大的難度，增菌雖然可以提高靈敏度，但在一定程度上稀釋了樣品中對PCR產生抑制作用的物質，其增加了檢測時間，很難滿足快速檢測的要求［20］。一種新型PCR技術——實時熒光PCR技術因其具有敏感度高、特異性強等優點而被廣泛應用到微生物檢測中，索標等［21］研究食品中熱損傷沙門氏菌選擇性增菌及實時熒光聚合酶鏈式反應檢測中，基于選擇性增菌培養液SEL建立一種實時熒光聚合酶鏈式反應檢測技術。SEL是Kim等［22］開發出來的用于沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7以及單增李斯特菌的選擇性增菌培養液，但目前對該培養基修復并增菌培養損傷致病菌的能力尚不清楚。將SEL用于亞致死單增李斯特菌修復，進而可以采用實時熒光PCR檢測。

2.2食品中單增李斯特菌亞致死修復技術

研究表明，單增李斯特菌的亞致死損傷過程是可逆的，受損單增李斯特菌在進行繁殖之前必須先經過修復過程。對于亞致死菌的修復，存在經典的修復理論［4］，包括：1）損傷菌在適當的溫度和培養基條件下能很快得到修復；2）修復過程發生在細菌繁殖之前，修復時間通常為1～6 h；3）完全修復的細菌對相應的選擇性添加物質反應正常；4）處理方式不同，所需的最優溫度和修復時間不同；有研究認為20 ℃是超高壓損傷的單增李斯特菌的最佳修復溫度，而一般研究菌體修復時多數采用37 ℃，修復的具體時間的長度是與損傷程度、菌種類型和損傷類型相關的，超高壓處理方法降低了亞致死單增李斯特菌的最佳修復溫度。

對于修復過程需要確定以下三方面：修復法的選擇、修復溫度的選擇和修復時間的選擇。第一，目前亞致死菌的修復法主要有兩種方法：固體修復法和液體修復法。常用的固體修復法有：濾膜法、表面覆蓋法、雙層瓊脂培養法、薄層瓊脂覆蓋法［23-27］。亞致死單增李斯特菌最為典型的固體修復法是雙層薄層平板法，該方法同樣也被應用到了許多其他致病菌的修復中，如大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌等。固體修復法的優點是可以減少因亞致死菌的繁殖而造成的計數誤差，更加準確判斷修復時間。但是固體修復法也存在缺點，操作較為繁瑣，傾倒上層培養基時會對亞致死單增李斯特菌造成二次損傷，甚至導致其死亡，且該方法的連續性不強，不適用于連續的污染分析。而液體修復法相比較操作較為簡單，不會對單增李斯特菌造成二次損傷，且液體修復后可進行連續的后續處理，更為適合實際檢驗工作［4］。

第二，亞致死菌常用的修復溫度為25、37 ℃，亞致死單增李斯特菌修復溫度一般定為37 ℃。從酶活力角度來看，37 ℃條件下過氧化酶、超氧化酶、熱休克蛋白等細胞保護酶類的活力較高，有研究表明，在培養基中添加過氧化氫酶可以提高熱損傷菌的修復率，過氧化氫酶等具有幫助蛋白裝配、跨膜、轉運、清除毒性基團和變性蛋白的清除等功能，可以提高熱損傷菌修復的能力［28］。第三，修復時間的確定標準是在選擇性培養基與非選擇性培養基上的菌落數接近或同時增加，則表示亞致死菌達到完全修復，此段時間為修復時間。修復時間過短，易造成漏檢或假陰性，修復時間過長，會由于大量繁殖而導致數值過大。修復時間過短或過長，都不利于正確反映熱加工食品的衛生狀況。

目前常采用增菌培養基對亞致死菌進行修復，BPW、TSB-YE、UPB、SEL［22］、SSL［29］、NB、蛋白胨等都可以作為亞致死單增李斯特菌的增菌培養基［4］。在修復過程中，一些物質的添加會影響受損細胞修復速度。段學輝等［30］研究發現氯化鎂、丙酮酸鈉及吐溫-80可以使亞致死菌體在選擇性培養基上得到不同程度地修復。吐溫-80作為液體表面活性劑，可修復細胞質膜的損傷，氯化鎂的添加補充了流失的鎂離子，丙酮酸鈉具有一定的還原性，能分解代謝過程中產生的副產物H2O2，從而解除H2O2的毒害作用。研究發現，Mg2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、酵母浸膏、丙酮酸鹽、過氧化氫酶、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖都有助于熱損傷單增李斯特菌的修復、再生長（表2）。由表中可以發現，向TSB培養基中加入0.6 g/100 mL酵母浸膏后，可以大大提高亞致死單增李斯特菌的修復效果。因此，在開發加快亞致死菌修復速度的方法過程中，需要將這些添加物考慮在內。

表2　影響亞致死單增李斯特菌修復的添加物［4-6］Table2 Effects of additives on the self-repair of sub-lethal injury in L. monocytogenes［4-6］

3　食品中單增李斯特菌亞致死檢測與修復技術的發展趨勢

雖然已經發展了諸多的單增李斯特菌亞致死的檢測方法和修復技術，這些方法都有各自的優點、缺點以及適用的對象和環境。但這些方法仍然面臨食品本身性質與檢測要求的挑戰，因此，為了保障食品安全性，未來還需要加大對單增李斯特菌快速檢測技術研究，開發更準確、更簡單快速的檢測方法和修復技術。

隨著現代免疫學和分子生物學理論和技術的不斷發展，免疫磁珠分離法［29］、酶免疫測定等免疫學技術、熒光探針技術［18］和PCR技術因其特異性強、敏感性高、操作簡單快速等優點而廣泛應用于食品致病菌的檢測中，目前也有部分技術逐漸應用于檢測亞致死狀態的食品致病菌。在基于這些檢測技術之前，采用合適的方法對亞致死單增李斯特菌進行修復，才能有效地檢測到處于亞致死狀態的單增李斯特菌，而修復過程中，大多采用選擇性增菌培養基來滿足不同細胞修復過程中所需要的營養。但更多的時候不僅僅只是對亞致死單增李斯特菌進行檢測，可能存在其他處于亞致死狀態的致病菌，當要檢測多種亞致死致病菌時，可能需要分別進行菌體選擇性增菌。所以有研究開發能同時對多種致病菌增菌的培養基，目前報道的共增菌培養基有NB、蛋白胨、SSL［31］、SEL［22］等。Kawasaki等［32］開發出一種No.17增菌液，可以用于食品中沙門氏菌、單增李斯特菌以及大腸埃希氏菌O157：H7同時非選擇性增菌培養，現在也已經應用于多重檢測平臺的開發。王虎虎等［4］以BPW、TSB-YE、UPB為備選共增菌介質對熱損傷沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7進行修復。實驗結果顯示TSB-YE培養基對熱損傷沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7的修復效果最好，且對前兩種菌的修復時間為2 h，對后一種菌的修復時間為4 h。了解能夠真正在一個檢查平臺中完成多種亞致死食源性致病菌的同時檢測，并開發能同時增菌培養多種亞致死目的致病菌的培養液是亞致死致病菌檢測的發展趨勢。

4　結 語

食品中亞致死單增李斯特菌給食品安全帶來嚴重隱患，人們必須對此給予足夠的重視。由于亞致死單增李斯特菌對選擇性培養基敏感，因此很容易造成檢測的假陰性結果。在食品安全檢測過程中，通過對亞致死單增李斯特菌進行修復，可以降低假陰性結果的出現，提高檢測的靈敏度。而在修復過程中需要考慮修復法、修復溫度、修復時間以及添加物質對修復程度的影響。隨著分子生物學的不斷發展，PCR反應體系中加入擴增內標技術正逐漸成為學者們的研究重點，食品中多種致病菌共修復增菌技術在食品安全檢測中也具有一定的應用前景。

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Progress in Understanding Sub-lethal Injury of Listeria monocytogenes in Food

XUAN Xiaoting， DING Tian*， LIU Donghong
（College of Biosystems Engineering and Food Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

Listeria monocytogenes （L. monocytogenes） is a class of zoonotic foodborne pathogens. The presence of sub-lethal injury of L. monocytogenes during food processing should not be ignored due to their self-repair capability under proper conditions. Therefore， the presence of sub-lethal injury pathogens is one of the hidden dangers of food safety. The detection and resuscitation of sub-lethal injury pathogens is one of the hottest topics of current research. By gathering and combining the related research， this paper reviews current methods for the detection and resuscitation of sub-lethally injured L. monocytogenes. Finally future trends in this area are also discussed.

sub-lethal injury； L. monocytogenes； detection； resuscitation； development trend

TS201.3

A

1002-6630（2015）03-0280-05

10.7506/spkx1002-6630-201503052

2014-01-26

浙江省自然科學基金項目（LQ13C200001）；中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目（2013QNA6010）；浙江大學優秀青年教師資助計劃（紫金計劃）項目

宣曉婷（1991—），女，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：21313057@zju.edu.cn

丁甜（1985—），男，講師，博士，主要從事預測微生物與風險評估研究。E-mail：tding@zju.edu.cn