siRNA抑制PTTG1表達對人腦膠質瘤細胞增殖、侵襲性的影響

閆海成　竇長武　田復明　妥少勇　王薇

【摘要】目的構建針對人腦膠質瘤細胞系的高效沉默PTTG1的RNAi載體；探討PTTFG1 siRNA干擾質粒對人腦膠質瘤細胞系U373增殖、侵襲性的影響。方法設計三對PTTG1基因干擾序列，合成能夠特異干擾PTTG1的siRNA，然后將其與pGenesil2載體連接，構建pGenesil2-PTTG1 siRNA干擾載體，在脂質體作用下將PTFG1 siRNA質粒轉染至膠質瘤U373細胞后，用RT-PCR和Western blot方法檢測PTTG1 mRNA及蛋白表達水平的變化，通過細胞增殖實驗、劃痕實驗和Transwell小室實驗檢測PTTG1對膠質瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。結果在膠質瘤U373細胞轉染3個不同的siRNA片段干擾PTTG1的表達，RT-PCR檢測結果顯示，PTFG1 siRNA1干擾質粒對PTFG1表達的抑制作用最明顯[（0.47±0.12）vs（1.00±0.15），P<0.01]。轉染PTFGl siRNA質粒的膠質瘤細胞U373在48h和72h細胞增殖能力均顯著低于對照組。細胞劃痕實驗顯示干擾PTTGl可明顯縮短U373細胞的遷移距離；Transwell小室結果顯示干擾PTTG1后U373的穿膜細胞百分率明顯下降[（58.00±8.72）%vs（36.3±7.76）%，P<0.05]。結論PTTG1 siRNA干擾質?？擅黠@抑制膠質瘤U373細胞PTTG1的表達，并可抑制膠質瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

【關鍵詞】垂體腫瘤轉化基因；RNA干擾；膠質瘤；侵襲

【中圖分類號】R739.4 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-0616（2015）21-09-05

腦膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，目前以手術治療為主，輔以放療及化療等綜合治療，但是由于膠質瘤的惡性程度高，呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織無明顯分界，易于復發，并隨著復發次數的增加其惡性程度也會不斷增加。因此，臨床療效仍不理想。目前膠質瘤研究的重要任務是研究與膠質瘤惡性進展相關的基因，為膠質瘤的診斷和治療尋找新的途徑。垂體腫瘤轉化基因（PTTG）是1997年，Pei等在大鼠垂體腫瘤組織中發現的，其中PTTG1是在MG63骨肉瘤細胞中被發現能夠抑制分離酶的活性，使姐妹染色體分離受阻，增加使細胞突變機率，從而導致腫瘤的發生發展。PTTG1基因在大多數惡性腫瘤及內分泌相關性腫瘤中均有較高表達，目前研究認為PTTG1基因與抑制染色體分離密切相關，還參與了血管生成，在腫瘤的發生發展及侵襲轉移中起到重要作用。本課題組在前期研究中已經證實PTTG1在人腦膠質瘤細胞中的表達較正常腦組織明顯增強，并與膠質瘤的惡性程度呈正相關。在本研究中我們應用RNA干擾技術，構建高效沉默PTTG1的siRNA干擾質粒，并將其轉染入膠質瘤細胞U373中，探討其對人腦膠質瘤細胞增殖、侵襲性的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料

膠質瘤細胞株U373（ATCC編號：HTB-17），第5～8代細胞用于做細胞學實驗，DMEM培養基，胎牛血清，大腸桿菌DH5α感受態細胞（購于天根生化有限公司），質粒Pgenesil 2（購買于武漢晶賽生物工程技術公司），RT-PCR試劑盒，鼠抗人PTTG1單克隆抗體（購于美國Santa Cruz公司）。

1.2實驗方法

1.2.1膠質瘤細胞的培養 膠質瘤細胞株U373用DMEM培養基（含10%胎牛血清）傳代培養，培養條件為37℃、5%CO₂、飽和濕度。細胞生長狀態良好時進行實驗，轉染PTTG1干擾質粒的細胞作為實驗組，轉染非干擾質粒的細胞作為對照組，每種實驗方法均選用同一批次細胞進行。

1.2.2重組Pgenesil2 PTTG1 siRNA的構建及鑒定

根據Genbank提供的PTTG1 cDNA序列（NM-004129），應用Ambion在線設計軟件篩選出三條PITG靶基因序列，分別為PTTG-1：TGGGAGAqL3UAAGTIqEA；PTFG-2：GTCTGTAAAGAC CAAGGGA；PTTG-3：GCATFCTGTCGACCCTGGA，根據上述靶序列設計出三對PTTG1干擾序列。

pGenesil2質粒經BamH I和HindⅢ雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠回收大片段。將上述合成的寡核苷酸片段溶解于退火緩沖液（50μL），分別取正鏈（2μL）、反鏈（2μL）和退火緩沖液（16μL），混勻，94℃水浴，3min，自然冷卻至室溫。用去離子水（99μL）稀釋退火產物（1μL），4℃保存。取稀釋后退火寡核苷酸鏈（1μL），Pgenesil2質粒載體（1μL），10×Ligase Buffer（1μL），加入T4連接酶（1μL），加入去離子水（6μL），22℃水浴，過夜。取DH5α（5μL），涂布于LB瓊脂平板上（含Kana抗性），置于37℃恒溫箱內培養。挑取3個單克隆菌落，接種于LB培養液（5mL，含Kana抗性）中，置于恒溫搖床中37℃培養過夜。用質粒提試劑盒提取質粒。經Sal Ⅰ酶切鑒定：將提取的質粒DNA（1μL），10×H Buffer（1μL），Sal Ⅰ（1μL），去離子水（7μL）混勻，37℃水浴反應3h，取5μL反應產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證產物，并將重組質粒菌液送大連寶生物公司測序。

1.2.3PTTG1 siRNA干擾效果鑒定 為提高PTTG1 siRNA干擾質粒的轉染效率降低細胞毒性，我們選用脂質體方法進行轉染，脂質體是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層，可以通過膜的融合及內吞作用，將外源物質轉移進入細胞內。將膠質瘤U373細胞接種于6孔細胞培養板（1×10⁵/孔）中，次日，當細胞密度達到70%～80%融合時用脂質體2000作為轉染試劑進行瞬時轉染，每孔中分別加入2μg質粒、8μg脂質體轉染試劑和100μL0.01M PBS混勻，室溫放置15min后，用PBS洗滌2次，棄上清，每孔中加入900μL含10%胎牛血清DMEM培養基，繼續培養48h提取RNA，72h后提取蛋白，用Western Blot檢測干擾效果。endprint

1.2.4MTT檢測PTTG1 siRNA對膠質瘤細胞增殖能力影響

將細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔中細胞數為3×10³個，每孔加入100μL培養基，每種細胞重復5個孔，同時設空白對照組（僅加培養基，不加細胞），37℃培養，分別于培養后24、48、72h檢測各孔吸光度值（OD值），在檢測前每孔加入20μL的MTT繼續培養4h后棄培養基，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，室溫避光孵育10min，用酶標儀570nm測定各孔吸光度值（OD值），繪制生長曲線。細胞生長抑制率（%）=（對照組OD值一實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.5細胞劃痕實驗實驗分為兩組，實驗組：轉染PTTG1 siRNA干擾質粒組，收集2mL轉染PTTG1 siRNA干擾質粒的細胞懸液接種于6孔板，待細胞生長至單層匯合，用移液器槍頭在培養板底部呈“一”劃痕，用PBS清洗，更換含1%胎牛血清DMEM培養液分別于劃痕后0、18和36h用顯微鏡觀察并照相，記錄最初劃痕區及不同遷移時間劃痕的距離。對照組：轉染PTTG1非干擾質粒組起始質粒為PTTG1非干擾質粒，其他步驟同上。

1.2.6Transwell小室遷移實驗 本實驗分為兩組，實驗組：轉染mGl siRNA干擾質粒組，對照組：轉染PTrGl非干擾質粒組。將聚碳酸濾膜（8μm）粘附于Transwell小室上方后，用無血清培養基稀釋Matrigel膠（1：3），加至Transwell上室，覆蓋整個聚碳酯膜，37℃，放置30min，使Matrigel聚合成膠。用0.25%胰蛋白酶消化各組細胞，PBS洗三次，重懸于含0.1%BSA的培養基中，取2×106/mL細胞懸液100μL加入上室，在下室內加入500μL全培，放于37℃孵箱繼續培養24h。棄去上室中的培養液，并用生理鹽水棉簽緩慢檫去Matrigel膠，使用0.1%結晶紫染色，置于倒置顯微鏡下觀察，10×40倍視野下隨機計數5個視野中的細胞數目，每個標本重復2次，本部分實驗重復2次，并以侵襲細胞占原細胞總數的百分比來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.3統計學分析

通過SPSS21.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料用（x±s）表示，若呈正態分布，兩組間數據行獨立樣本t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，若數據不服從正態分布，用秩合檢驗比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1PTTGl siRNA質粒干擾效果鑒定

構建的三個pGenesil2-PTTG-1干擾質粒經Sal I酶切電泳鑒定及測序證實序列正確，將上述質粒分別轉染U373細胞，48h后提取細胞總RNA，用RT-PCR方法檢測構建的PTTG1 siRNA干擾質粒抑制PTTG1表達的效果，結果圖1-A顯示，與轉染非干擾質粒的對照組相比，轉染3個干擾質粒后PTTGl mRNA表達明顯減少，組間多重比較結果顯示組間差異有統計學意義（F=12.784，P=0.002），其中PTTG1 siRNA1干擾質粒對PTTG1表達的抑制作用最為明顯[（0.47±0.12）vs（1.00±0.15），t=4.679，P=0.001]。再取轉染干擾質粒72h后的細胞，用Western Blot方法進一步驗證三個PTTG1siRNA干擾質粒對膠質瘤細胞PTTG1的干擾效率（圖1-B），結果與RT-PCR結果一致。上述結果均證實三個PTTG1 siRNA干擾質?？梢种颇z質瘤細胞U373中PTTG1的表達，其中PTTG1 siRNA1的抑制作用最為明顯。因此，后續的實驗選用PTTG1siRNA 1干擾片段來進行。

2.2PTTG1對膠質瘤細胞增殖能力的影響、侵襲和遷移能力的影響

MTT檢測細胞增殖活性結果，轉染PTTG1siRNA質粒的膠質瘤細胞U373在48和72h細胞增殖能力均顯著低于對照組，結果提示PITG1 siRNA質?？梢燥@著抑制膠質瘤細胞U373的增殖。見表1。

2.3PTTG1對膠質瘤細胞侵襲和遷移能力的影響

瞬時轉染PTTG1 siRNA干擾質粒于膠質瘤U373細胞48h后，再通過劃痕實驗檢測PTTG1對膠質瘤細胞遷移能力的影響。見圖2-A。結果顯示，通過定性比較轉染PTTG1 siRNA干擾質粒的U373細胞與轉染非干擾質粒組，結果發現在劃痕后18h和36h的遷移距離明顯縮短，其中在36h改變化較為明顯，說明PTTG1促進膠質瘤細胞的遷移，抑制PTTG1后可抑制細胞遷移。

采用Transwell小室檢測PTTG1對膠質瘤細胞的侵襲能力的影響，圖2-B中箭頭所指為穿過Martrigel膠的細胞，結果顯示與對照組相比，轉染PTTG1 siRNA干擾質粒后U373的穿膜細胞百分率明顯減少（[58.00±8.72）%vs（36.3±7.76）%，t=-3.214，P=0.032]，這些結果表明PTTG1可以促進膠質瘤細胞的侵襲，抑制PTTG1后膠質瘤細胞的侵襲能力明顯降低。

3討論

膠質瘤是一種預示著不良預后的實體腫瘤。其早期診斷困難，侵襲性強，即使在腫瘤診斷技術與治療方法日新月異的今天，全世界膠質瘤患者的預后依然沒有顯著的提高。腦膠質瘤的形成是一個多基因參與的復雜過程，由于原癌基因被激活，抑癌基因失活，從而造成細胞信號傳導異常、細胞的凋亡缺陷等，從而造成細胞增殖的失控，最終轉化為惡性。近年來，大量研究發現了與腦膠質瘤形成及進展相關的原癌基因及抑癌基因，為膠質瘤的診斷及治療提供了更為廣闊的基礎。

垂體瘤轉化基因1（pituitary tumor-transforminggene 1，PTTG1）編碼的蛋白最早在垂體瘤細胞中發現，之后鑒定為保全素（securin），因其在細胞周期中調控有絲分裂姐妹染色單體的分離，又稱分離酶抑制蛋白。PTTG1是一種原癌基因，在很多細胞活動中發揮重要作用，比如有絲分裂、DNA損傷/修復、凋亡和基因轉錄調節，以及器官發育與代謝過程中起到重要作用。大量證據表明，PTTG1和腫瘤發展、惡性轉移密切關系。除了血癌和星形膠質細胞瘤外，甲狀腺癌、結直腸癌、卵巢癌、胸腺癌、肝細胞癌（HCC）、肺癌和食管癌中的mG表達都有所增加。

研究發現體外PTTG過度表達可以誘導細胞發生轉化及裸鼠的腫瘤形成，并與一些腫瘤高侵襲性相關，因此PTTG1已經被證實是與腫瘤轉移相關的重要標記基因。我們前期的研究發現PTTG1在膠質瘤中表達量與腫瘤的惡性程度呈正相關的實驗結果，也支持上述推斷。在本研究中我們應用RNA干擾技術構建了PTTG1 siRNA干擾質粒，可明顯抑制膠質瘤細胞U373中PTTG1的表達，客觀證明了構建的干擾載體有效，為膠質瘤的靶向治療提供了有效措施。

Baldwin等研究發現，采用RNAi技術，可使U87MG細胞株中的PKC表達下調，并可明顯降低腫瘤細胞的運動性與增殖侵襲性。本研究中MTT檢測細胞增殖活性結果顯示轉染PTTG1 siRNA質粒的膠質瘤U373細胞在48h和72h細胞增殖能力均顯著低于對照組，提示在PTTG1基因被干擾后，目的細胞的生長和存活的能力受到了明顯的抑制，細胞活力也產生了巨大的變化。進一步的細胞遷移和Transwell實驗也均證實PTTG1 siRNA通過降低膠質瘤細胞PTTG1表達來明顯抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力。最近研究證實基質金屬蛋白酶（MMPs）在結腸癌、乳腺癌及卵巢癌中通過降解基底膜的Ⅳ型膠原成分和胞外基質，調節腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤細胞之間以及宿主細胞之間的相互粘附、移行，參與了腫瘤侵襲和轉移的過程，有學者在垂體腫瘤中研究發現PTTG1與MMP9存在較高表達，但兩者之間的表達關聯仍然存在較大爭論。另有研究表明，降低PTTG1蛋白在膠質瘤細胞中的高表達，不僅可以有效的降低其侵襲性，而且可以提高惡性膠質瘤患者的生存率并改善預后，這與本實驗結果一致。上述結果提示PTTG1是與膠質瘤增殖、侵襲相關的靶標基因，但其促進膠質瘤增殖和侵襲的具體作用機制尚需要進一步研究，RNA干擾技術為研究膠質瘤的生物學活性及治療提供了新手段。endprint