補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響※

高　毅　刁志虹　王彥敏　穆春暉　何　源　李　蓓　王雙雙　楊　琳

(河北省中醫院口腔科，河北　石家莊　050011)

實 驗 研 究

補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響※

高毅刁志虹△王彥敏1穆春暉2何源李蓓王雙雙楊琳

(河北省中醫院口腔科，河北石家莊050011)

【摘要】目的觀察補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨細胞(MC3T3-E1)堿性磷酸酶(ALP)活性的影響，探討其對成骨細胞分化的作用機制。方法將20只SD大鼠隨機分為含藥血清組和無藥血清組，各10只。含藥血清組大鼠予補腎活血固齒方灌胃，無藥血清組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，均灌胃7 d后抽取腹主動脈血制備成含藥血清和無藥血清。胎牛血清組為直接購買的PAA胎牛血清。分別用含10%含藥血清、10%無藥血清及10%胎牛血清的培養基培養MC3T3-E1細胞24、48、72 h，檢測MC3T3-E1細胞中ALP的含量。結果含藥血清組培養24、48、72 h后MC3T3-E1細胞ALP含量均高于胎牛血清組及無藥血清組同期水平，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，但胎牛血清組與無藥血清組同期差異無統計學意義(P>0.05)；含藥血清組MC3T3-E1細胞ALP含量隨培養時間的延長而明顯增加(P<0.05)。結論補腎活血固齒方可增強MC3T3-E1細胞中ALP活性，促進MC3T3-E1細胞向成骨細胞分化，且均有一定時間依賴性。

【關鍵詞】成骨細胞；堿性磷酸酶；大鼠；動物，實驗；中藥療法

牙周炎是以牙槽骨進行性吸收破壞為主要特征，以牙齦出血、牙周袋形成、牙齒松動等為主要癥狀的口腔科常見病，根治牙周炎的關鍵是通過成骨細胞和破骨細胞的調節作用，促進牙槽骨的再生或阻止牙槽骨吸收，成骨細胞在這一過程中發揮重要作用[1]。堿性磷酸酶(ALP)是成骨細胞早期分化的標志酶，它的活性可以代表成骨細胞的分化活性和成骨細胞的分化水平。中醫認為，腎為封藏之本，腎藏精，精生髓，而髓又能養骨，腎精足則骨髓生長有源，骨骼可得到營養而強韌，故臨床多以補腎類中藥治療牙周炎引起的牙齒松動[2]。本實驗擬通過觀察補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨(MC3T3-E1)細胞ALP活性的影響，探討補腎活血固齒方對成骨細胞分化的作用機制，為臨床用藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物及細胞株健康雄性SD大鼠20只，清潔級，體質量280～300 g，飼養環境室溫保持在18～25 ℃，空氣流通，12 h維持光照，動物在籠中自由攝食飲水，由河北醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2008-1-033。ATCC CRL-2594小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14(MC3T3-E1 Subclone l4)，由中國科學院上海細胞庫提供。

1.2中藥制備補腎活血固齒方藥物組成：淫羊藿15 g，補骨脂15 g，熟地黃10 g，當歸10 g，丹參10 g，知母10 g，甘草3 g。藥物加10倍量蒸餾水煎煮1.5 h過濾，加同量蒸餾水重煎1.5 h過濾，合并2次濾液濃縮至150 mL裝袋備用。中藥材由河北省中醫院中藥房提供，煎制由煎藥室完成。

1.3主要實驗試劑與儀器

1.3.1實驗試劑α-MEM培養基，美國GIBCO公司；胎牛血清，PAA Laboraties GmbH公司；葉酸、胰蛋白酶，美國Amresco公司；β-巰基乙醇，北京鼎國生物技術有限責任公司；乙二胺四乙酸(EDTA)，天津市永大化學試劑開發公司；戊巴比妥，華北制藥股份有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，北京索萊寶科技有限公司；ALP試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.3.2實驗儀器HF240二氧化碳(CO2)培養箱，上海力申科學儀器有限公司；BSC-1100ⅡA2生物安全柜，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；TE2000-U熒光倒置顯微鏡，日本NiKon公司；B40型醫用低速離心機，安新縣白洋離心機廠；D-37520高速離心機、Type354酶標儀，美國Thermo Electron Corporation公司；HKA-A2450-230精密電子天平，意大利BEL Engineering公司；水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市江南儀器廠；全自動生化儀，日本SYSMEX公司。

1.4實驗方法

1.4.1血清制備及分組將20只SD大鼠隨機分為含藥血清組和無藥血清組，每組各10只。含藥血清組的血清制備：含藥血清組大鼠按體表面積折算等效劑量，以0.475 g/kg生藥量灌胃，每日2次，連續灌胃7 d，第7 d第2次灌胃后間隔2 h再次灌胃，末次灌胃1 h后，通過腹主動脈取血，以3 000 r/min離心20 min，取上清液，56 ℃水浴滅活30 min，抽濾除菌后，分裝，-20 ℃保存備用。無藥血清組大鼠以等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，灌胃次數及血清制備方法同含藥血清組。胎牛血清組為直接購買的PAA胎牛血清。

1.4.2細胞培養將MC3T3-E1細胞培養于α-MEM培養基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素)，5% CO2、95%濕度、恒溫37 ℃的細胞培養箱中培養，每3 d換液1次，7 d左右細胞基本鋪滿瓶底。吸去原培養液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗2遍，0.25%胰蛋白酶1 mL，37 ℃消化1 min，鏡下觀察細胞收縮，變圓，α-MEM培養基1.5 mL終止消化，反復吹打細胞成細胞懸液，移至離心管1 000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入適量α-MEM培養基，輕輕吹打，使管底細胞懸浮，分散均勻，用于下一步實驗。

1.4.3MC3T3-E1細胞ALP活性檢測分別取3塊24孔板，每孔接種細胞約15 000個。正常培養48 h后，每塊板均換用含10%含藥血清、10%無藥血清及10%胎牛血清培養基培養，每組設8個復孔，分別于培養24、48、72 h后各取出1塊24孔板，吸凈每孔培養基，PBS沖洗2遍，每孔加入0.2% Triton X-100 0.5 mL。將24孔板放入4 ℃冰箱，24 h后吹打細胞，直至鏡下觀察無完整細胞結構。吸出每孔的細胞裂解產物，分別加入離心管中，1 000 r/min離心5 min。每支離心管中的上清液分別移入新的離心管，采用全自動生化儀檢測每孔ALP活性。

2結果

3組MC3T3-E1細胞ALP含量比較見表1。

組 別n培養時間24h48h72h胎牛血清組81.277±0.1031.479±0.1701.566±0.227無藥血清組81.457±0.1991.604±0.1761.670±0.137含藥血清組81.767±0.316*1.819±0.257*△1.918±0.252*#

與胎牛血清組及無藥血清組同期比較，*P<0.05；與同組培養24 h比較，△P<0.05；與同組培養48 h比較，#P<0.05

由表1可見，含藥血清組培養24、48、72 h后MC3T3-E1細胞ALP含量均高于胎牛血清組及無藥血清組同期水平，比較差異均有統計學意義(P<0.05)，但胎牛血清組與無藥血清組同期差異無統計學意義(P>0.05)；含藥血清組MC3T3-E1細胞ALP含量隨培養時間的延長而明顯增加(P<0.05)。

3討論

牙周炎的主要臨床癥狀為牙周袋的形成、袋壁炎癥、牙槽骨吸收及牙齒松動,是導致成年人牙齒喪失的主要原因，嚴重危害患者的健康，影響患者的生活質量。根治牙周炎的關鍵是能否阻止牙槽骨吸收或促進牙槽骨再生，牙槽骨代謝的穩定依賴于成骨細胞和破骨細胞的平衡，因此治療牙周炎的藥物無論治療機制如何，最終必須通過調節骨的微環境、成骨細胞與破骨細胞的平衡而發揮作用[3]。

我們所選用的研究對象MC3T3-E1細胞是1981年日本學者Kadama等從新生C57BL/6小鼠顱頂骨細胞中建株的成骨細胞系，具有和原代培養的顱頂成骨細胞ALP活性、基質鈣化等類似的生物學特性，常作為研究體外成骨細胞分化及骨代謝的細胞模型[4-5]。成骨細胞在骨形成過程中可分為分裂增殖、分化成熟及基質礦化3個階段[6]。ALP是骨形成的必需酶，ALP表達升高是啟動礦化的必備條件，其作用是為水解磷酸酯為沉積羥基磷灰石提供必要的磷酸，解除其對礦物質形成的抑制作用，從而促進羥基磷灰石的形成，促進細胞成熟、鈣化[7-8]。成骨細胞主要在分化早期表達ALP，ALP的表達也標志著成骨細胞分化開始，當成骨細胞處于高度分化時，ALP活性也達到最高，而到成骨細胞分化晚期細胞進入礦化期時，細胞內的ALP活性則開始下降[9-11]。

牙周炎相當子中醫學牙宣、齒豁、齒衄范疇，主要病因是脾胃濕熱、腎精虧虛、氣血不足等。中醫很早就注意到腎與牙齒的關系，在《素問·上古天真論》就有“女子七歲腎氣盛，齒更發長；丈夫八歲腎氣實，發長齒更”的說法。我們經過大量的臨床觀察及研究，牙周炎患者多數屬腎精虧虛型，且應用補腎活血固齒方治療該型患者療效顯著。補腎活血固齒方是以“腎主骨”理論為基礎，方中淫羊藿、補骨脂為君，補腎助陽，強筋壯骨；熟地黃、當歸、丹參為臣，補血活血，填精益髓；知母消熱瀉火，滋陰潤燥；甘草清熱解毒，調和諸藥。

本實驗研究結果顯示，含藥血清組培養的MC3T3-E1細胞內ALP含量明顯高于胎牛血清組及無藥血清組，且隨著作用時間的延長，藥物作用效果越明顯，顯示出一定的時間依賴效應，說明補腎活血固齒方可通過增強ALP活性來促進MC3T3-E1細胞向成骨細胞分化，而發揮治療牙周炎的功效。

參考文獻

[1]錢毅，李矛，劉琪.人健康和牙周炎性牙槽骨成骨細胞的體外培養和鑒定初探[J].口腔醫學，2013，33(7):469-472.

[2]顧明，趙蕾，高靂，等.中藥補腎固齒丸對牙周炎治療作用機制的探討[J].北京口腔醫學，2009，17(3):132-134.

[3]黃萍，紹培，趙美林，等.桂皮醛對成骨細胞的增殖及成骨功能的影響[J].中國口腔種植學雜志，2009，14(2):88-89.

[4]Sudo H，Kodama HA，Amagai Y，et al.In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria[J].J Cell Biol，1983，96(1):191-198.

[5]Kodama H, Amagai Y, Sudo H, et al. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria[J]. Jpn J Oral Biol，1981，23：899-901.

[6]Manolagas SC，Jilka RL.Bone marrow, cytokines, and bone remodeling. Emerging insights into the pathophysiology of osteoporosis[J].N Engl J Med，1995，332(5):305-311.

[7]Gundberg CM.Biochemical markers of bone formation[J].Clin Lab Med，2000，20(3):489-501.

[8]甕媛媛,，續惠云,安龍,等.骨樣細胞MLO-Y4與成骨樣細胞MC3T3-E1生物學特性的比較[J]. 中國細胞生物學學報，2010,32(2)：261-267.

[9]黃潔，程云英.大鼠成骨細胞的體外培養和生物學特性的研究[J].南京鐵道醫學院學報，2000，19(2):88-90.

Effects of Bushen-huoxue-guchi formula on alkaline phosphatase activities of pre-osteoblasts in mice calvarium

GAOYi*,XIZhihong,WANGYanmin,etal.

*DepartmentofStomatology,HospitalofTraditionalChineseMedicineinHebeiProvince,Hebei,Shijiazhuang050011

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of Bushen-huoxue-guchi formula on alkaline phosphatase (ALP) activities of pre-osteoblasts in mice calvarium (MC3T3-E1), and its treatment mechanism of periodontitis. Methods20 SD rats were randomly divided into medicine-contained serum group (n=10) and non-medicine serum group (n=10). Rats in medicine-contained serum group were received Bushen-huoxue-guchi formula by intragastric administration. Rats in non-medicine serum group were received 0.9% sodium chloride injection by intragastric administration. Blood samples were obtained from abdominal aorta 7 d after intragastric administration, and the serum was separated to medicine-contained serum group and non-medicine serum group. The cells were cultured with 10% medicine-contained serum, 10% non-medicine serum and 10% fetal bovine serum respectively. The contents of ALP in MC3T3-E1 were detected after 24, 48 and 72 h. ResultsThe contents of ALP in medicine-contained serum group after 24, 48 and 72 h were higher than those in fetal calf serum and non-medicine group at the same period, with statistical differences (P<0.05), and there was no statistical difference between fetal calf serum and non-medicine group (P>0.05). The contents of ALP in medicine-contained serum group were obviously increased over time (P<0.05). ConclusionBushen-huoxue-guchi formula can enhance ALP activity of MC3T3-E1 cells, promote differentiation of MC3T3-E1 cells to osteoblasts, with some time-dependence.

【Key words】Osteoblast; Alkaline phosphatase; Rats; Animals; Experiment; Chinese herbs therapy

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.03.027

通訊作者：△河北省石家莊市第一醫院口腔科，河北石家莊050011

作者簡介：高毅(1965—)，女，教授，主任醫師，博士。從事口腔科臨床、科研、教學工作。

【中圖分類號】R276.8；R285.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2016)03-0409-04

※ 項目來源：河北省科學技術廳科學技術研究與發展計劃(編號：13277730D)；河北省中醫藥管理局2014年度中醫藥類科研計劃課題(編號：2014028)

1河北省石家莊市第三醫院口腔科，河北石家莊050011

2北京市東城區第一人民醫院口腔科，北京100010