MicroRNA-625在食管鱗癌中的表達及臨床意義*

劉莎莎岳冬麗陳新峰平玉張毅

·臨床研究與應用·

MicroRNA-625在食管鱗癌中的表達及臨床意義*

劉莎莎①②岳冬麗①陳新峰①平玉①②張毅①②

目的：探討microRNA-625（miR-625）在食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的表達及其與臨床參數的相關性，探究miR-625對ESCC細胞系KYSE70遷移和增殖的影響。方法：實時熒光定量（real-time polymerase chain reaction，PCR）檢測2014年2月至2015年4月鄭州大學第一附屬醫院手術切除的86例ESCC及癌旁正常組織、ESCC細胞系和正常永生化食管上皮細胞系中miR-625的表達，統計學分析其表達水平與ESCC患者臨床病理參數及預后的相關性。Transwell實驗檢測miR-625對細胞遷移能力的影響，細胞計數Kit-8（CCK-8）法檢測miR-625對細胞增殖的影響。結果：ESCC組織中miR-625的表達明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05），ESCC細胞系中miR-625表達水平與正常永生化食管上皮細胞相比，顯著下調（P＜0.05）。miR-625的表達與腫瘤直徑、分化程度及淋巴結轉移呈負相關（P＜0.05）。隨訪數據提示miR-625低表達組患者預后更差（P＜0.05）。miR-625能夠抑制ESCC的遷移和增殖（P＜0.05）。結論：miR-625作為抑癌基因參與ESCC的發生發展，提示miR-625可能作為一個ESCC治療靶點和預后判斷的分子標志物。

miR-625 食管鱗癌 遷移 增殖 預后

食管癌作為發病率較高的惡性腫瘤之一已越來越被關注。其發病率和死亡率分別占我國各類腫瘤的第5位和第4位。我國食管癌以食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主，占食管癌90%以上［1-2］。盡管隨著ESCC的診斷和治療手段的進步，但因為癌細胞的無限增殖和轉移侵襲特性，ESCC患者術后3年和5年生存率僅為43.7%和26.2%［3］。因此，研究ESCC遷移增殖的機制并尋找新的治療靶點，對提高ESCC的療效具有重要的臨床意義。

miRNA是一類長度約21～25個核苷酸的非編碼RNA，在轉錄后水平調控靶基因的表達。成熟miRNA通過RNA誘導的沉默復合體結合到靶mRNA上，依賴于序列的互補機制，剪切或阻遏靶mRNA，沉默靶基因的表達［4］。事實上，miRNA調節了約30%的蛋白編碼基因，并參與多種生物學功能的調控，包括細胞增殖、凋亡及分化。因此，miRNA的功能異常與人類多種疾病相關。大量的研究發現，多種miRNA與腫瘤的發生及轉移等過程相關［5］。因此，miRNA成為治療原發腫瘤并同時抑制腫瘤轉移的有效靶點及治療工具。研究發現，miR-625能夠通過調節ILK基因抑制胃癌的侵襲轉移［6］；miR-625的低表達與多種腫瘤轉移及不良預后有關［7］。但miR-625在ESCC中的報道相對較少，所以本研究從臨床方面，研究ESCC組織及ESCC細胞系中miR-625表達情況，以及miR625與ESCC患者生存預后的相關性并探討miR625與ESCC增殖轉移的關系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本收集2014年2月至2015年4月鄭州大學第一附屬醫院手術切除的新鮮ESCC標本及相對應的正常標本86例，所有組織都經病理學確診，患者在術前均未行放、化療。標本采集后，采用液氮速凍，然后于-80℃儲存以備提取組織總RNA。組織標本的收取均已獲得鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并簽署知情同意書。所有受試對象均參加每3個月1次的隨訪計劃，隨訪采用電話隨訪方式與患者或家屬取得聯系。

1.1.2細胞正常永生化食管上皮細胞系Het-1α和人ESCC細胞系KYSE70、KYSE450、EC109、EC9706、TE1均由本研究課題組實驗室保存。

1.1.3主要試劑RPMI 1640培養液購自美國Hy-Clone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco公司；RNAiso plus、cDNA逆轉錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ均購自日本TAKARA公司；miR625 mimics和inhibitor由上海吉瑪設計；Real time PCR引物由上海生工合成。

Het-1α、KYSE70、KYSE450、EC109、EC9706和TE1均為貼壁細胞，培養于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.3實量定量PCR檢測miR-625的表達

RNAiso plus法提取Het-1α及ESCC細胞和ESCC組織中總RNA，Nanodrop 2000分光光度計檢測RNA純度及濃度。OD260/280比值在1.80～2.00之間，符合實驗要求。按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，按SYBR Green試劑說明書于實時熒光定量PCR儀進行擴增。PCR引物為miR625上游引物為5'-AGGGGG AAAGTTCTATAGTCC-3'，通用下游引物為5'-TGGT GTCGTGGAGTCG-3'。內參U6上游為5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，內參U6下游為5'-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3'。

1.4脂質體瞬時轉染

轉染前24 h鋪KYSE70細胞，待細胞融合至70%～80%時，用Lipofectamine 3000轉染miR625類似物（mimics）、mimics對照和miR625抑制劑（inhibitor）、inhibitor對照，24 h后收細胞，進行后續實驗。

1.5Transwell實驗檢測細胞遷移能力

取轉染過的KYSE70細胞，以每4×104個/mL的密度將細胞接種于8 μm Transwell板的上室，下室加入含10%胎牛血清的完全培養液600 μL，于37℃、5%CO2培養箱培養24 h，再經甲醇固定，0.1%結晶紫染色后，于顯微鏡下隨機選取5個視野（×200）觀察并拍照，計數每個視野中穿過濾膜的細胞數。

當短路故障電流流過故障指示器時會上報故障信息，由于配電網呈單電源輻射狀運行，因此當故障指示器有故障信息上報時，則可知故障一定在故障指示器下游。若故障指示器沒有故障信息上報時，則可知故障一定在故障指示器上游。所以根據故障指示器上報的故障信息，均可提供一種可疑故障區段的證據。

1.6CCK8檢測細胞增殖能力

96孔板每孔鋪5×103個經轉染過的細胞，分別在24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8溶液，混勻，細胞培養箱內繼續培養1 h后，酶標儀450 nm波長測吸光度值。

1.7統計學分析

應用SPSS 17.0統計學軟件分析實驗數據。采用student's t檢驗，配對樣本采用配對t檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1在ESCC組織中及食管癌細胞系中miR-625低表達

通過Real-time PCR檢測86對ESCC組織及癌旁正常組織中miR-625的mRNA表達水平。結果顯示，miR-625在ESCC組織中的表達明顯低于癌旁正常組織（P＜0.001，圖1A）。同時檢測正常永生化食管上皮細胞系Het-1α及6種ESCC細胞系中miR-625的mRNA表達水平，結果同樣顯示，miR-625在6種ESCC細胞系中的表達明顯低于Het-1α，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1B）。

2.2miR-625表達與腫瘤臨床病理參數相關性分析

86例ESCC患者miR-625表達水平與腫瘤病理參數分析結果顯示，其表達與腫瘤淋巴結轉移情況、分化及腫瘤大小呈負相關，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

2.3miR-625表達與患者生存預后的關系

miR-625高表達及低表達組的化療比例分別為45%（19/42），34%（15/44）（P=0.291）；miR-625高表達及低表達組的放療比例分別為31%（13/42），36%（16/ 44）（P=0.596），高表達和低表達組放化療比例相近，無顯著性差異，具有較好的可比性生存分析結果表明miR-625高表達患者中位生存時間為23個月，低表達患者中位生存時間為16.5個月。Kaplan-Meier單因素分析顯示miR-625表達與ESCC患者總生存相關。差異具有統計學意義。（P=0.000 9；95%CI：0.124 6～0.586 9；HR=0.270 4）（圖2）。

圖1　miR-625在ESCC組織中及食管癌細胞系中的表達Figure 1miR-625 expression in ESCC tissues and cell lines

圖2　miR-625的表達與ESCC患者生存的關系Figure 2miR-625 expression and prognosis in ESCC patients

2.4miR-625抑制ESCC細胞的遷移能力

將miR-625 miR-625模擬物和抑制劑成功轉染到KYSE70細胞系后，Transwell實驗結果顯示，和對照組相比，miR-625模擬物組的KYSE70細胞遷移能力明顯受到抑制（圖3A），而miR-625抑制劑組的KYSE70細胞的遷移能力明顯增強（圖3A），差異具有統計學意義（P＜0.05，圖3B）。體外Transwell結果表明，miR-625能夠抑制ESCC細胞的遷移。

2.5miR625抑制ESCC細胞的增殖能力

為了進一步檢測miR-625對ESCC細胞體外增殖能力的影響，本研究采用CCK-8實驗分別檢測轉染過miR-625模擬物組和miR-625抑制劑組KYSE70細胞的體外增殖能力。結果顯示，與miR-625模擬物對照組相比，過表達miR-625的KYSE70細胞的增殖能力明顯下調（圖4A）。與抑制劑對照組相比，敲低miR-625的KYSE70細胞的增殖能力明顯升高（圖4B），差異具有統計學意義（P＜0.05）。體外CCK-8結果表明，miR-625能夠抑制ESCC細胞系的增殖。

表1　ESCC患者miR-625表達量與臨床病理參數的相關性Table 1Correlation between the clinicopathological characteristics and miR-625 expression in 86 ESCC patients

圖3　miR625對ESCC細胞遷移的影響Figure 3Effect of miR-625 on ESCC cell migration

圖4　miR-625對ESCC細胞系增殖的影響Figure 4Effect of miR-625 on ESCC cell proliferation

3 討論

食管癌是最常見的消化道系統惡性腫瘤之一，對人類的生活和健康造成嚴重的威脅。目前認為，浸潤轉移是晚期ESCC的重要死因之一［8］。因此進一步研究食管癌侵襲和轉移機制，顯得尤為重要。

隨著科學的發展，曾經被忽視的一類小分子的非編碼RNA-miRNA越來越受到關注，甚至成為生命研究的熱點。miRNA約占整個基因組的1%，卻能調控30%的基因的表達。已有大量研究表明miRNA能夠調控腫瘤的侵襲轉移。miR-656能夠通過抑制BMP-2蛋白受體來抑制腦膠質瘤細胞的增殖、侵襲、轉移［9］；miR-612能夠抑制肝細胞癌的侵襲轉移［10］；miR-140可以通過靶向TGFBR1和FGF9抑制肝細胞癌的生長和轉移［11］；miR-300通過靶向Twist蛋白抑制食管癌的上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程，EMT賦予細胞侵襲和轉移能力［12-15］。miR-21能夠通過下調腫瘤抑制性基因Pdcd4的表達進而促進結直腸癌的侵襲轉移特性［16］；miR-139能夠通過靶向Ⅰ型胰島素樣生長因子受體抑制結直腸癌的侵襲轉移［17］；miR-331-3p通過靶向PHLPP促進肝癌的增殖及轉移［18］。其中，研究發現miR-625的下調能夠促進食管癌的增殖和侵襲［19］。這與本研究結果相一致，本研究進一步分析ESCC中miR-625的表達及其與臨床預后的關系，將miR-625的表達與臨床參數緊密聯系，為miR-625作為治療ESCC的潛在靶點提供更加充實的臨床依據。

本研究結果表明miR-625在ESCC組織和ESCC細胞系中表達明顯低于癌旁正常組織及正常永生化食管上皮細胞系。miR-625的表達與淋巴結轉移、分化程度及腫瘤大小呈負相關，miR-625高表達的患者生存時間明顯長于miR-625低表達。這些結果提示miR-625在ESCC的發生發展中發揮重要作用。為了明確miR-625在ESCC增殖轉移中發揮的重要作用，進行細胞增殖實驗及Transwell實驗。當ESCC細胞中miR-625過表達時，能夠顯著抑制腫瘤細胞的遷移和增殖能力。相反，抑制miR-625的表達可促進細胞增殖及遷移能力。Zhou等［20］在分析乳腺癌組織時發現miR-625較正常對照組顯著上調，且發現miR-625能夠抑制癌細胞的增殖及遷移。有研究發現miR-625通過調控IGF2BP1/PTEN通路，從而抑制肝癌的轉移，在肝癌的發生發展中發揮重要作用［21］。這與本研究結果基本一致。上述研究結果提示miR-625在ESCC的發生發展中發揮著抑癌基因的功能。

綜上所述，miR-625在ESCC的發生發展中發揮著抑癌基因的功能，其低表達與淋巴結轉移、分化及不良預后相關，且miR-625可抑制ESCC細胞的增殖及遷移能力，提示了miR-625可能是ESCC轉移標志物及治療靶點，為改善ESCC的診治提供新的實驗依據。

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（2016-06-06收稿）

（2016-09-13修回）

（編輯：周曉穎校對：孫喜佳）

劉莎莎專業方向為腫瘤免疫、腫瘤微環境的研究。

E-mail：liushasha910729@163.com

Clinical significance of microrna-625 expression in esophageal squamous cell carcinoma

Shasha LIU1，2，Dongli YUE1，Xinfeng CHEN1，Yu PING1，2，Yi ZHANG1，2
Correspondence to:Yi ZHANG；E-mail:yizhang@zzu.edu.cn

1Biotherapy Center，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China

This work was supported by the Foundation for Science and Technology Program of Ministry of Public Health，Henan Province，China（No.201501004）

Objective:To analyze the correlation of miR-625 expression with clinicopathological characteristics in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）and to explore the effect of miR-625 on the migration and proliferation of ESCC cells.Methods:The expression level of miR-625 was determined through real-time PCR in 86 paired human ESCC tissue specimens and tumor-adjacent normal esophageal tissue specimens，ESCC cell lines，and esophageal epithelial cell line.The associations of miR-625 expression with clinicopathological characteristics and survival in ESCC patients were analyzed.Transwell and CCK-8 assays were performed to examine the effect of miR-625 expression on migration and proliferation of ESCC cells.Results:Compared with tumor-adjacent normal specimens，miR-625 was significantly downregulated in ESCC tissue specimens（P＜0.05）.MiR-625 expression was decreased in ESCC cell lines compared with human esophageal epithelial cell lines（P＜0.05）.Lower miR-625 expression was associated with poorer prognosis and survival.The migration and proliferation abilities of ESCC cells were inhibited by miR-625 overexpression（P＜0.05）.Conclusion:MiR-625 acts as a tumor suppressor gene in the development and progression of ESCC，suggesting that miR-625 may serve as an efficient prognosis biomarker and a potential therapeutic target for ESCC.

miR-625，ESCC，migration，proliferation，prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.18.656

①鄭州大學第一附屬醫院生物治療中心（鄭州市450052）；②鄭州大學生命科學學院

*本文課題受衛生部科技攻關項目（編號：201501004）資助

張毅yizhang@zzu.edu.cn