新生大鼠耳蝸K?lliker器在體凋亡的研究△

楊軍何圓圓，2

新生大鼠耳蝸K?lliker器在體凋亡的研究△

楊軍1何圓圓1，2

目的 了解不同天齡新生大鼠耳蝸K?lliker器的形態變化，研究凋亡相關因子的mRNA及蛋白的表達水平，探討K?lliker器在聽覺功能發育過程中凋亡的機制。方法 選取出生后不同天齡的Sprague－Dawley大鼠共192只，其中出生后1天（P1）、5天（P5）、12天（P12）各6只大鼠耳蝸冰凍切片后，通過蘇木精－伊紅染色及免疫熒光染色等方法，觀察耳蝸K?lliker器的形態結構變化；取P1大鼠6只行耳蝸基底膜免疫熒光觀察；提取出生后1、3、5、7、10、12及14天（P1、P3、P5、P7、P10、P12和P14）大鼠耳蝸基底膜mRNA（各6只）及蛋白（各18只），運用real－time PCR及蛋白質印跡的方法，觀察出生后各天齡組大鼠耳蝸基底膜K?lliker器凋亡過程中bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9的表達規律。結果 出生后大鼠聽力出現之前其耳蝸K?lliker器支持細胞的形態自頂回向底回從高柱狀向矮柱狀變化，同時支持細胞的數量逐漸減少。出生后不同天齡大鼠耳蝸基底膜的caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的mRNA和蛋白的表達水平均呈明顯的時間依賴性。結論 在大鼠出生后、聽力出現前耳蝸發育的整個階段，K?lliker器自底回向頂回逐漸發生退化；caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的m RNA和蛋白的表達表現為時間依賴性。

大鼠； 耳蝸； K?lliker器； 支持細胞； 凋亡

鼠類動物出生時其聽覺器官并未發育成熟，其出生后至12～14天沒有聽覺。K?lliker器（亦稱大上皮嵴）是耳蝸發育過程中的一種暫態結構，位于耳蝸內毛細胞（IHCs）內側的柱狀支持細胞團［1］，存在于胚胎中晚期和出生后早期，是耳蝸未成熟的標志之一；出生后，K?lliker器細胞發生凋亡，數目減少，在有聽覺之后，當耳蝸成熟時，K?lliker器消失［2］。

以往有研究觀察到K?lliker器在出生后12～14天消失［3］，但目前對出生后聽力發育過程中K?lliker器的形態結構變化及生物化學變化知之甚少，且對K?lliker器支持細胞的凋亡及其機制也少有研究。本實驗擬通過研究不同天齡新生大鼠耳蝸K?lliker器的形態變化及凋亡相關因子的m RNA及蛋白的表達變化，探討K?lliker器在新生大鼠聽覺功能發育過程中凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取健康清潔級Sprague－Dawley大鼠192只，雌雄不拘，所有大鼠父輩耳廓反射靈敏，耳部外形正常，由中國科學院上海實驗動物中心提供。取出生后1天（P1）、5天（P5）以及12天（P12）各6只，用于制備耳蝸切片；另選取P1大鼠6只，用于行耳蝸基底膜免疫熒光觀察；選取生后1、3、5、7、10、12及14天（P1、P3、P5、P7、P10、P12、P14）大鼠各6只，提取基底膜RNA；選取P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠各18只，提取基底膜蛋白。

1.2 試劑 Tissue－Tek冷凍組織包埋劑由日本Sakura公司提供；L－多聚賴氨酸及10%山羊血清由美國Sigma公司提供；兔抗大鼠Myosin－VIIa購自美國Proteus BioSciences公司；山羊抗大鼠Sox2抗體購自美國Santa Cruz公司；逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit）及Realtime試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM，Perfect Real Time）由Takara公司提供；小鼠抗大鼠β－actin抗體購自美國Protein Tech公司；兔抗大鼠caspase－3抗體、caspase－8抗體、caspase－9抗體、bcl－2及cleaved caspase－3抗體購自美國CST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 耳蝸冰凍切片 取P1、P5及P12大鼠各6只快速斷頭，取下顳骨后，放入新鮮4%多聚甲醛溶液中。在解剖顯微鏡下打開顳骨壁，打開聽泡，分離耳蝸，挑去鐙骨底板，開放圓窗及卵圓窗，并在蝸頂打一小孔，置于4%多聚甲醛溶液內，4℃固定24 h。P5及P12大鼠耳蝸放入10%EDTA溶液中于4℃冰箱脫鈣，P5組脫鈣2 d，P12組脫鈣5 d，每天更換新鮮脫鈣液，用0.01 M PBS漂洗3次，在4℃耳蝸通過10.0%、12.5%、15%和20%的系列蔗糖磷酸緩沖液梯度，每一梯度至耳蝸沉底。將耳蝸浸入Tissue－Tek冷凍組織包埋劑中，耳蝸快速冷凍在－20℃用冷凍切片機沿蝸軸作冰凍切片，片厚6～8 μm，切片置于涂L－多聚賴氨酸的載玻片上融解，并在空氣中干燥，冰凍切片可儲存在－20℃冰箱或立即用于實驗。

1.3.2 HE染色 取出耳蝸切片，置室溫晾干。蒸餾水漂洗，蘇木精染液染色5 min。蒸餾水洗去多余蘇木精染液后，滴加1%鹽酸酒精分化5～10 s，細流水沖洗，至細胞核呈藍色。滴加0.1%伊紅染液染色1 min，依次經70%、85%、95%、100%梯度酒精脫水，其中95%、100%酒精各2次，每次各為5 min，二甲苯透明2次，每次5 min；滴加適量中性樹膠，加蓋玻片封閉，封片過程避免出現氣泡。過夜晾干，顯微鏡下觀察P1、P5、P12大鼠耳蝸K?lliker器形態并攝片。

1.3.3 基底膜免疫熒光染色 取6只P1大鼠，快速斷頭，在體視解剖顯微鏡下自頂回至基底回仔細分離出血管紋和螺旋韌帶，自基底膜底回完整撕下基底膜，將基底膜置于4%多聚甲醛溶液室溫4 h，PBS漂洗3次，每次5 min。滴加0.1%Triton X－100溶液通透40 min，PBS漂洗；加10%山羊血清封閉30 min，滴加1：300兔抗大鼠Myosin－VIIa抗體及1：200山羊抗大鼠Sox2抗體，置于4℃冰箱過夜，復溫1 h，PBS漂洗。滴加Dy Light 594山羊抗兔IgG及Dy Light 488兔抗山羊IgG，避光室溫孵育2 h，PBS漂洗，避光滴加50%甘油磷酸緩沖液，加蓋玻片封閉。熒光顯微鏡下觀察耳蝸基底膜頂、中、底回K?lliker器細胞的數量并攝片。Myosin－VIIa標記毛細胞，顯示為綠色；Sox2標記所有的支持細胞，包括K?lliker器支持細胞，顯示為紅色。

1.3.4 Real time PCR檢測不同天齡大鼠耳蝸感覺上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9 m RNA的表達 常規提取P1、P3、P5、P7、P10及P12大鼠（各6只）耳蝸基底膜mRNA，反轉錄為cDNA后，SYBR Green嵌合熒光定量real－time PCR檢測bcl－2、caspase－3、caspase－8及 caspase－9 m RNA的表達。PCR引物設計見表1。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個循環；以β－actin為內參，根據2－ΔΔCt法分析bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9 m RNA表達量。設對照組的表達量為1，計算實驗組中各個因子的相對表達量。

表1 引物序列和PCR擴增產物

1.3.5 凋亡相關蛋白的蛋白質印跡檢測（Western blot） 新鮮抽提的P1、P3、P5、P7、P10及P12大鼠耳蝸基底膜組織，配置含蛋白酶抑制劑PMSF（苯甲基磺酰氟）的蛋白質抽提試劑RIPA，提取同鼠齡耳蝸感覺上皮的總蛋白，經蛋白含量測定及蛋白變性后，SDS－PAGE（十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺）凝膠電泳，轉膜，封閉1 h，分別用兔克隆bcl－2、caspase－3、caspase－8、caspase－9及cleaved caspase－3一抗及小鼠克隆β－actin抗體4℃孵育24 h，洗膜3次，每次5 min，加1：1 000辣根過氧化物標記的二抗（由美國Protein Tech公司提供）孵育60 min，洗膜3次，每次10 min，凝膠成像分析系統分析各不同天齡組大鼠耳蝸感覺上皮的bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9及cleaved caspase－3蛋白的表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0（SPSS Inc，美國）同步統計軟件處理數據，組間比較采用方差分析（F檢驗），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同天齡大鼠耳蝸K?lliker器形態比較 大鼠出生后，其耳蝸形態發育尚不成熟，K?lliker器仍存在（圖1）?？梢奝1和P5組大鼠耳蝸底回、中回及頂回K?lliker器均還未退化，從底回到頂回，K?lliker器內支持細胞的形態從矮柱狀向高柱狀變化，支持細胞的數量逐漸減少，從8～14排減少至3～4排；P12組耳蝸底回和中回的K?lliker器基本消失，而頂回的K?lliker器還未退化；說明新生大鼠耳蝸的發育及K?lliker器的退化是從底回開始逐漸向頂回進展。

2.2 耳蝸基底膜免疫熒光染色顯示K?lliker器支持細胞數量變化 P1大鼠耳蝸的基底膜Myosin－VIIa和Sox2的免疫熒光染色結果表明，其耳蝸底回、中回和頂回中K?lliker器支持細胞均存在，且自底回向頂回K?lliker器支持細胞數量依次明顯減少（圖2）。說明在出生后大鼠的耳蝸仍處在發育過程中，K?lliker器的支持細胞存在凋亡使細胞數目減少。

2.3 不同天齡大鼠耳蝸感覺上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9的m RNA表達P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠耳蝸感覺上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9的m RNA表達呈一定的時間依賴性；bcl－2的m RNA表達水平在P3、P5和P7組均顯著增高，約為P1組的2～2.5倍（P＜0.05）（圖3a）；P3組caspase－3的mRNA表達水平約為P1組的1.8倍（P＜0.05）（圖3b）；且caspase－8 mRNA的表達水平在P3組最高，約為P1組的2.5倍（P＜0.05），而P14組caspase－8 m RNA的表達水平明顯降低，約為P1組的1／2（P＜0.05）（圖3c）；各組caspase－9 m RNA表達規律與caspase－3 m RNA和caspase－8 mRNA不同（圖3d）；P5、P10組和P12組的caspase－9 m RNA表達水平分別約為P1組的0.6～0.7倍（P＜0.05）。

2.4 不同天齡大鼠耳蝸感覺上皮的bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9及cleaved caspase－3蛋白的表達 Western blot檢測P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠耳蝸感覺上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9蛋白的表達呈一定的時間依賴性（圖4）；與P1組相比，P3組的caspase－3的水平明顯較高，而P12組和P14組相對較低；caspase－8蛋白表達在P3組最高，而在P10組降至與P1相當；與P1組相比，caspase－9的蛋白水平在P12組和P14組明顯降低，但其余各組與P1組相比無明顯變化；bcl－2蛋白表達在P3、P5及P7組有明顯增高。

Western blot檢測P1、P3組大鼠耳蝸感覺上皮cleaved caspase－3蛋白的表達顯示，與caspase－3蛋白表達水平相似，cleaved caspase－3蛋白的表達也呈一定的時間依賴性（圖5），與P1組相比，P3組的cleaved caspase－3蛋白的表達水平明顯較高。

圖1 P1、P5、P12新生大鼠耳蝸K?lliker器的HE染色

圖2 P1新生大鼠耳蝸基底膜免疫熒光染色

3 討論

眾所周知，在發育成熟的耳蝸中，聲波振動導致內毛細胞（IHCs）去極化，之后電壓門控的鈣離子通道開放，鈣離子內流觸發傳入性神經遞質谷氨酸釋放，通過如此機械－電信號轉導、神經遞質傳遞，最終產生聽覺。在大鼠出生后、聽覺產生前，發育中的螺旋神經元產生的動作電位依賴于非聲音介導的自發性活動［4］，這種非聲音介導的自發性活動起源于耳蝸［5］，且有促進聽覺神經元的存活及成熟［5～7］、突觸的發育［8，9］及音頻定位的建立［10］等作用。Tritsch等［1］研究表明K?lliker器的支持細胞可以自發性節律性釋放ATP，與IHCs上的嘌呤受體結合導致鈣離子內流，之后IHCs去極化并釋放谷氨酸；谷氨酸激活螺旋神經元產生動作電位，以此模擬外界聲輸入的效應，在不成熟的耳蝸中產生不依賴聲音的自發性活動。前期研究發現，新生大鼠耳蝸K?lliker器的支持細胞在體外能夠釋放ATP［11］。在出生后12～14天的鼠類動物，外耳道開放，K?lliker器不復存在，支持細胞終止釋放ATP，自發性活動停止，耳蝸功能成熟，耳蝸中出現聲音介導的電活動。因此，K?lliker器在出生后大鼠耳蝸發育過程中發揮著重要的作用。作為耳蝸未成熟的標識之一，K?lliker器細胞的胞體細長，頂部有雙極或單極突起，其末端可見微絨毛，胞核小，位于胞體中部，部分細胞在胚胎晚期和出生后早期可能存在有絲分裂活動。在耳蝸的發育階段，大鼠耳蝸K?lliker器自內側向外側自底回向頂回發生退化，其退化的機制可能是細胞凋亡［12，13］。細胞凋亡的信號可以通過細胞內或細胞外的多個獨立的途徑啟動從而誘導凋亡，而半胱天冬酶（caspase）是許多器官凋亡級聯反應的關鍵酶。當線粒體膜電位損失后，細胞色素C自線粒體釋放，而細胞色素C可以激活caspase－3，目前caspase－3是研究最多的凋亡途徑啟動的下游的酶。caspase－8通過與位于細胞膜上的死亡受體結合并形成三聚體而啟動外源性凋亡通路，caspase－8一旦被激活，便可以激活下游的半胱天冬酶，如直接裂解caspase－3或間接造成線粒體膜的破裂釋放細胞色素C。caspase－9參與線粒體介導的活化和隨后釋放到細胞質的細胞色素C的激活，從而激活caspase－3［14］。半胱天冬酶的激活受多種因素的調節，如B－細胞淋巴瘤2（bcl－2）蛋白家族?？沟蛲龅鞍譩cl－2是眾所周知的bcl－2家族成員，可以對抗細胞凋亡。

圖3 各組耳蝸K?lliker器bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9 mRNA的表達

圖4 Western blot分析各組耳蝸K?lliker器bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9蛋白的表達

圖5 Western blot分析P1及P3組耳蝸K?lliker器cleaved caspase－3蛋白的表達

目前少有研究集中在耳蝸K?lliker器的形態發育，對K?lliker器的認識僅限于其在出生后的短時間內會消失［15］。本研究結果顯示，新生的P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠耳蝸底回、中回及頂回的K?lliker器的支持細胞的形態從底回向頂回逐漸從矮柱狀向高柱狀變化，支持細胞的數量逐漸減少，因此可以推測在新生大鼠耳蝸發育的過程中，存在K?lliker器支持細胞的凋亡。

在內耳中，參與凋亡途徑的分子在耳蝸發育中發揮了重要的作用［15］，半胱天冬酶在細胞程序性死亡／凋亡中作用顯著［16］，caspase－3在凋亡裂解過程中是不可缺少的［17］。以往的研究表明，在胚胎期和出生后早期的發育過程中，caspase－3影響聽覺系統的形成和維持［13］；在2周齡的caspase－3（－／－）小鼠耳蝸，K?lliker器在底回、中回和頂回中均存在，沒有退化，推測caspase－3依賴的凋亡途徑對哺乳動物聽覺系統發育和功能成熟是必需的。在野生型鼠類動物，K?lliker器凋亡的這些信號途徑亟待深入研究［18］。

本研究結果顯示，在K?lliker器中，caspase－3在大鼠出生后第一天即有高表達，在P5～P7組大鼠，K?lliker器支持細胞的凋亡達高峰，而自P10起凋亡減弱。bcl－2的表達趨勢和上述趨勢一致，即在體K?lliker器支持細胞中凋亡和抗凋亡同時存在。而在K?lliker器支持細胞離體實驗中，證實K?lliker器支持細胞離體培養時不凋亡，而具有明顯的增殖能力［19］。結合在體和離體實驗結果，推測在體K?lliker器支持細胞不僅只存在凋亡，也存在增殖。當凋亡和抗凋亡失衡時，在體K?lliker器支持細胞才表現為凋亡或增殖。細胞增殖的數量遠少于細胞凋亡的數量時，在組織結構上表現為K?lliker器的消失。本研究首次揭示了在耳蝸發育過程中，caspase－3和bcl－2在在體K?lliker器中表達的時間趨勢，初步了解這兩種蛋白在耳蝸發育過程中的作用。

在細胞凋亡的途徑中，caspase－8和caspase－9是處于上游的半胱天冬酶。從本研究結果看，P3組大鼠K?lliker器caspase－8顯著高表達；在P1～P10大鼠，caspase－9均有明顯的表達。推測在體K?lliker器的凋亡經細胞外凋亡途徑啟動進而通過細胞外和細胞內兩條途徑共同參與，但是具體機制需要進一步的研究證明。

綜上所述，在出生之后聽覺產生之前，大鼠耳蝸K?lliker器從底回向頂回逐漸發生退化，從底回至頂回，K?lliker器內的支持細胞的形態從矮柱狀向高柱狀變化，支持細胞的數量逐漸減少；在出生后耳蝸發育的整個階段，K?lliker器的退化表現為時間依賴性。本研究首次揭示了在大鼠出生后耳蝸發育過程中，caspase－3和bcl－2在在體K?lliker器中表達的時間趨勢。

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（2015－09－04收稿）

（本文編輯 周濤）

The Apoptosis of the K?lliker Organ in the Cochlea of Newborn Rat in Vivo

Yang Jun*，He Yuanyuan
（*Department of Otorhinolaryngology－Head＆Neck Surgery，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai Jiaotong University School of Medicine Ear lnstitute，Shanghai Key Laboratory of Translational Medicine on Ear and Nose Diseases，Shanghai，200092，China）

Objective To explore the apoptosis mechanisms of the K?lliker organ during the development of the auditory function，through the obser vation of the morphological changes，the expression of the apoptosis－related mRNA or protein of the K?lliker organ in the cochlea of newborn rats.Methods A total of 192 Sprague－Dawley rats at different days after parturition（P）were used.There were P1，P5，and P12 rats（6 rats in each group）for hematoxylin－eosin staining and immunohistochemistry to investigate the morphological changes using frozen sections of the cochlea.Six rats at P1 were used for the immunofluorescence of the cochlear basal membrane.The sensory epitheliums in P1，P3，P5，P7，P10，P12 and P14 rats（6 rats each）were separated to extract mRNA（6 rats each）and protein（18 rats each），respectively.The differential expressions of the bcl－2，caspase－3，caspase－8 and caspase－9 through the real－time PCR and western blot during the apoptotic process of the K?lliker organ were studied.Results After birth，the supporting cells in the K?lliker organ showed the morphological change from the high columnar to short columnar and the disappearance with a base－to－apex gradient.The resultsof real－time PCR and western blot showed the expression pattern of bcl－2，caspase－3，caspase－8 and caspase－9 mRNA and protein in the cochlear sensory epithelium at 1st，3rd，5th，7th，10th，12thand 14thday.This indicates a significant time－dependent along the course of development.Conclusion After birth，but prior to the onset of hearing，the K?lliker organ in the cochlea of newborn rats degraded with a base－to－apex gradient throughout the developmental period of the cochlea.The expression of the caspase－3，caspase－8，caspase－9 and bcl－2 in the K?lliker organ during this period also showed in a time－dependence pattern.

Rat； Cochlea； K?lliker organ； Supporting cells； Apoptosis

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.012

時間：2016－6－29 16：11

R339.16

A

1006－7299（2016）04－0371－06

△ 國家自然科學基金（81170919，81470689）、國家科技部973課題（2014CB541705）、上海市科委重大項目（14DJ1400201，14DZ2260300）資助

1 上海交通大學醫學院附屬新華醫院耳鼻咽喉－頭頸外科 上海市耳鼻疾病轉化醫學重點實驗室 上海交通大學醫學院耳科學研究所（上海 200092）； 2 南京醫科大學附屬無錫人民醫院耳鼻咽喉科

楊軍，男，湖北人，主任醫師，博士，主要研究方向為耳蝸發育及耳蝸信息轉導。

楊軍（Email：yangjun67＠hotmail.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1611.024.html