甜菜堿對大腸桿菌K88的抑菌效果研究

■曲恒漫 文 媛 王佳榮 周巖民 溫 超

（南京農業大學動物科技學院，江蘇南京 210095）

甜菜堿是一種季銨型水溶性生物堿，化學名稱為三甲基甘氨酸。甜菜堿廣泛分布于動物、植物和微生物機體中，主要生理功能是提供活性甲基，為肉堿、肌酸、嘌呤及蛋氨酸等多種物質的合成提供原料，參與氨基酸、蛋白質、脂肪的代謝[1]。在飼料中添加甜菜堿具有促進動物生長、調節滲透壓、改善胴體組成、提高肉質等作用，對水生動物具有誘食作用[2-5]。近年來的研究表明，甜菜堿對幾種人類臨床常見致病菌具有一定的抑菌作用[6-7]，但對動物體內常見致病菌是否有抑菌效果尚未見報道。為此，本試驗以飼料中常用的無水甜菜堿及甜菜堿鹽酸鹽為試驗材料，以對仔豬危害較大的大腸桿菌K88為研究對象，分析兩種甜菜堿產品的體外抑菌活性，旨在為甜菜堿在飼料中的應用研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用無水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽由宜興市天石飼料有限公司提供，純度分別為96%、97%。大腸桿菌K88購于國家獸醫微生物菌種保藏中心。

1.2 菌種的活化

將-20℃保存的大腸桿菌K88解凍后接種到LB液體培養基中，37℃、160 r/min振蕩培養12 h后，再次接種到新鮮LB培養基中，培養3 h進入對數期，備用[7]。

1.3 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

吸取1 ml培養到對數期的大腸桿菌K88菌液加入10 ml含無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽濃度均分別為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 mg/ml的LB培養基中，同時設置只加菌液和只加無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽的對照管，37℃、200 r/min恒溫振蕩培養24 h后觀察結果。取未見細菌生長的上清液100 μl涂布到瓊脂平板，37℃培養18 h后計數，觀察瓊脂平板菌落生長狀況，并根據試驗結果調整甜菜堿濃度，菌落個數少于5個的平板所對應的最小甜菜堿濃度為MIC，無細菌生長的平板所對應的最小甜菜堿濃度為最小殺菌濃度（MBC）。試驗重復3次[1]。

1.4 不同培養時間對無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽抑菌效果的影響

在10 ml高壓滅菌生理鹽水中加入一定質量的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽配制成MIC或MBC的溶液，加入100 μl培養到對數生長期的細菌菌液，37℃、200 r/min振蕩培養，同時設置一個細菌的純培養作為空白對照。分別培養0、0.5、1、2、4、8、16、24 h后取出，菌液梯度稀釋后，取適宜稀釋度的菌液涂布于瓊脂平板，37℃培養18 h后計數，計算抑菌率，繪制曲線圖。試驗重復3次。

1.5 不同濃度的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88抑菌效果的影響

在10 ml高壓滅菌生理鹽水中加入不同質量的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽配制成 4、5、6、7、8、9、15 mg/ml的溶液，移取100 μl培養到對數生長期的細菌菌液加入其中，37℃、200 r/min振蕩培養，同時設置一個細菌的純培養作為空白對照。培養24 h后取出，菌液梯度稀釋后，取適宜稀釋度的菌液涂布于瓊脂平板，37℃培養18 h后計數，計算抑菌率，繪制曲線圖。試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度（見表1）

表1 不同濃度無水甜菜堿及甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88的抑菌效果

如表1所示，當無水甜菜堿濃度提高到800 mg/ml時仍可見大量細菌生長，說明無水甜菜堿對大腸桿菌K88的抑菌效果不明顯。甜菜堿鹽酸鹽的最小抑菌濃 度 (MIC)為 6.25 mg/ml，最 小 殺 菌 濃 度(MBC)為8.125 mg/ml。

2.2 不同培養時間對甜菜堿鹽酸鹽抑菌效果的影響（見圖1）

如圖1所示，在甜菜堿鹽酸鹽濃度為6.25 mg/ml時，隨培養時間的延長，抑菌率逐漸增加，當抑菌時間達到16 h時，抑菌率超過50%，可見該濃度甜菜堿鹽酸鹽在16 h以后才會達到明顯的抑菌效果；在甜菜堿鹽酸鹽濃度為8.125 mg/ml時，抑菌率隨時間延長迅速提高，24 h后抑菌率達到90%，可見甜菜堿鹽酸鹽濃度達到8.125 mg/ml時具有抑菌和殺菌作用。

圖1 甜菜堿鹽酸鹽在不同培養時間對大腸桿菌K88的抑菌率

2.3 不同濃度甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88抑菌效果的影響（見圖2）

由圖2可以看出，隨著甜菜堿鹽酸鹽濃度增大，抑菌率逐漸增加，當濃度達到7 mg/ml時，抑菌率超過50%，達到抑菌效果，當濃度達到9 mg/ml時，抑菌率超過90%，達到殺菌效果。

圖2 不同濃度甜菜堿鹽酸鹽對大腸桿菌K88的抑菌率

3 討論

近年來，部分文獻報道了甜菜堿的體外抑菌作用，如張愛君等[6]發現甜菜堿對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有明顯的抑制作用。黃忠民等[8]亦發現甜菜堿對金黃色葡萄球菌有顯著的抑制作用，并推測可能的抑菌機制是：甜菜堿作為一種帶正電荷的季銨鹽類化合物，容易吸附于帶負電荷的金黃色葡萄球菌表面并穿透其細胞壁，作用于細胞膜和酶體系，抑制其呼吸作用，進一步使細菌外膜裂解，新陳代謝被抑制而死亡。但上述文獻中均未說明所用甜菜堿劑型。為此，本試驗比較了無水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽大腸桿菌K88的體外抑菌作用，結果發現無水甜菜堿對大腸桿菌K88抑菌效果并不明顯，抑菌效果遠遠弱于甜菜堿鹽酸鹽，其原因可能為：無水甜菜堿呈中性，而甜菜堿鹽酸鹽呈強酸性，添加甜菜堿鹽酸鹽后使培養基pH值降低，從而使大腸桿菌K88細胞內外的的蛋白質變性，細胞膜和酶失去生物活性，生命活動無法進行而導致死亡。甜菜堿鹽酸鹽大腸桿菌K88的MIC為6.25 mg/ml，與張愛君等[6]的研究結果一致。本試驗還發現，當甜菜堿鹽酸鹽濃度提高或培養時間延長時，抑菌率隨之提高，說明其抑菌效果呈劑量和時間依賴性。

4 結論

無水甜菜堿對大腸桿菌K88抑菌效果不明顯，而甜菜堿鹽酸鹽有一定抑菌作用，最小抑菌濃度為6.25 mg/ml，最小殺菌濃度為8.125 mg/ml。隨著甜菜堿鹽酸鹽濃度提高或培養時間延長，抑菌率提高。