20723例親子鑒定中19個STR基因座的突變分析

畢潔，暢晶晶，李妙霞，余純應

（1.北京明正司法鑒定中心，北京 100191；2.公安部物證鑒定中心，北京 110000）

20723例親子鑒定中19個STR基因座的突變分析

畢潔1，暢晶晶2，李妙霞1，余純應1

（1.北京明正司法鑒定中心，北京 100191；2.公安部物證鑒定中心，北京 110000）

目的觀察并分析肯定親權關系的案件，探索STR基因座的突變規律。方法采用Goldeneye 20A試劑盒對20723例肯定親權關系的案件篩選等位基因突變事件，統計各基因座的突變率和突變等位基因的來源、片段大小、突變步數及重復單位的增加或減少情況，分析突變相關因素的特點。結果19個STR基因座共發現548例突變，觀察到557個突變事件，基因座的突變率為0.07‰～2.23‰。父系突變與母系突變的比例為3.06∶1。突變以一步突變為主，增加與減少重復單位的情況相當；二步以上（含二步）突變更易出現重復單位減少。突變主要發生于中等位基因，重復單位增減比例相當，長等位基因突變中重復單位減少顯著多于增加。父系突變出現重復單位增加與減少的比例相當，母系突變重復單位減少較增加多見。結論各基因座的突變率差異具有統計學意義，當出現1～2個基因座不符合遺傳規律時，應當加測其他檢測系統，并結合突變基因座的信息計算PI值，以進一步明確鑒定意見。

法醫遺傳學；親子關系；短串聯重復序列；DNA突變分析

短串聯重復序列（STR）基因座是目前最常用的親權鑒定遺傳標記，具有多態性高、個體識別能力強、非父排除概率高、突變率高等特點[1]。其中，STR發生突變可能使親權鑒定面臨錯判的風險，因而有必要對STR基因座的突變規律與特點有所認識。本研究通過大量樣本檢測，對目前常用的Goldeneye 20A檢測系統中觀察到的突變規律及特點進行分析。

1 材料與方法

1.1 樣本

本中心日常檢案中肯定親權的案件20 723例，均為北方漢族人群，樣本類型有血斑、口腔拭子、帶毛囊的毛發、羊水、精斑、組織等。

1.2 DNA提取和STR分型

采用Chelex-100法提取樣本DNA，經Goldeneye 20A試劑盒［基點認知技術（北京）有限公司］擴增，擴增體系和擴增條件按試劑盒說明書進行。擴增產物在3130xl型基因分析儀（美國Thermo Fisher公司）上進行電泳，采用GeneMapper?ID-X軟件進行基因分型。

1.3 突變等位基因的確定

從有下述特點的案例中識別突變的等位基因：19個STR基因座中檢出1～2個不符合孟德爾遺傳定律的基因座，增加檢測STRtyper-10G試劑盒[2]（珠?？频巧锛夹g有限公司），未再出現新的不符合遺傳規律的基因座，且累積親權指數（CPI）大于 10000；出現新的不符合遺傳規律的基因座，增加檢測Goldeneye 22NC試劑盒［基點認知技術（北京）有限公司］，若被檢子代為女性，對被檢父母與女孩再增加檢測Goldeneye 17X試劑盒［基點認知技術（北京）有限公司］，若被檢子代為男性，對被檢父與男孩增加檢驗Yfiler Plus試劑盒（美國Thermo Fisher公司），未再出現不符合遺傳規律的基因座，且CPI值大于10000。在滿足上述條件下，對于不符合孟德爾遺傳規律的基因座，視為突變基因座，并判斷突變的來源。對于親代和子代均為純合子的突變基因座，換用其他試劑盒（如Globalfiler系統）進行復核，以排除無效基因并驗證分型。

參照文獻[3-5]將每個基因座等位基因按片段大?。ㄈQ于重復次數的多少）從小到大排列，排列在前面25%的判斷為短等位基因，中間50%判斷為中等位基因，后面25%判斷為長等位基因。

1.4 統計學分析

對突變基因座的數量、突變來源、突變步數、突變等位基因的片段大小及重復單位的增加或減少進行統計，通過直接計數法得到突變基因座的突變率；分析突變來源、突變步數、突變等位基因片段大小在整體突變事件中所占比例，并通過SPSS 19.0軟件進行統計，分析上述突變相關因素之間的關系，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般資料

20723例肯定親子關系的案例中，三聯體7957例，父子二聯體7463例，母子二聯體5303例，共觀察到28680次減數分裂。548例案例發生了557次突變，其中539例存在單個基因座的父源性或母源性突變，2例父源性和母源性同時突變（D18S51：父14/15，子16/23，母20/ 22；D13S317：父11/14，子10/15，母11/12），7例存在2個基因座的父源性或母源性突變。

2.2 突變率和突變來源

19個STR基因座的突變情況見表1。其中Penta E基因座的突變率最高，TPOX基因座最低，19個STR基因座的平均突變率為1.02‰。19個基因座的突變率經χ2檢驗，χ2=206.793，P＜0.05，提示各基因座的突變率之間差異具有統計學意義。

表1 19個基因座在20723例肯定親子關系案例（28680次減數分裂）中發生突變的次數和突變率（N=28680）

548例突變案例中，三聯體為311例（319次突變），父子二聯體為188例（189次突變），母子二聯體為49例（49次突變）。311例三聯體中來自父系的突變205次，來自母系突變67次，47次不能確定突變來源（表2）。父系突變與母系突變的比例為3.06∶1。

2.3 突變步數及重復單位增減分析

557次突變事件中，545次（97.84%）為一步突變，7次（1.26%）為二步突變，5次（0.90%）為三步突變。

突變表現為重復單位增加的有213次，重復單位減少的有232次，不能明確重復單位增減的有112次（表3）。經χ2檢驗，χ2=4.810，P＜0.05，提示一步突變與二步及以上突變中出現重復單位增加和減少的情況之間差異具有統計學意義，一步突變中重復單位增加和減少的次數相當，二步及以上突變中重復單位減少的次數明顯多于增加的次數。

表2 三聯體突變來源觀察（次）

表3 突變步數與重復單位的增減（次）

2.4 突變等位基因片段大小及其與重復單位增減的關系

發生在短等位基因的突變有9次，中等位基因464次，長等位基因56次，無法明確等位基因長度的28次。各類等位基因突變增加或減少重復單位的情況見表4。中、長等位基因突變出現重復單位增加與減少經χ2檢驗，χ2=19.076，P＜0.05，即中、長等位基因突變出現重復單位增減的差異具有統計學意義。因發生在短等位基因上的突變次數較少，故沒有納入此次統計。

2.5 突變來源與重復單位增減的關系

三聯體中，來自父系突變205次，90個等位基因表現為重復單位的增加，89個等位基因表現為重復單位的減少，26個等位基因不能確定重復單位的增減；來自母系突變67次，17個等位基因表現為重復單位的增加，42個等位基因表現為重復單位的減少，8個等位基因不能確定重復單位的增減（表5）。經χ2檢驗，χ2=8.324，P＜0.05，提示父源突變與母源突變中出現重復單位增加和減少的情況差異具有統計學意義，父源突變中重復單位增加和減少的次數相當，母源突變中重復單位減少的次數明顯多于增加的次數。

表4 突變等位基因片段大小與重復單位增減的關系（次）

表5 突變來源與重復單位增減的關系（次）

3 討論

3.1 突變率

本研究觀察到19個STR基因座的突變率在0.07‰～2.23‰，除Penta E、FGA、D12S391基因座外，其余16個基因座的突變率均小于2‰，各基因座的突變率之間差異具有統計學意義，所以在使用突變率大于2‰的基因座進行親權鑒定時，應注意突變的問題。19個STR基因座的平均突變率為1.02‰，低于目前常用的平均突變率2‰[6]，結合各基因座的突變率計算PI值更為科學[4]。

重復單位數目多的基因座長度較長，其多態性一般較高，突變率也較高[1，7]。吳薇薇等[8]對中國28個省/區漢族人群41個STR基因座多態性數據分析顯示，Penta E的多態性最高（DP值0.9873，H值0.9140），TPOX的多態性最低（DP值0.5577，H值0.6141），本研究觀察到的突變率最高和最低的基因座與其一致。

3.2 突變來源分析

STR基因座的突變與性別有關，一般的規律是父方基因突變比母方多見。分析原因是男性精子細胞分化經歷的細胞分裂次數比卵細胞多10倍，其次是精子染色體中堿基替換的累積比卵細胞快2倍[9]。本研究觀察三聯體的突變為311例（319次突變），父系突變與母系突變的比例為3.06∶1，與文獻[7，9-11]報道的父系突變率是母系突變率3.5倍的結論相接近。但是本研究父系突變與母系突變的比例是聯合應用19個STR基因座檢測得出的，就單個基因座而言，父系突變與母系突變的比例差異很大（表2）。

3.3 突變機制

STR基因座的突變是DNA復制滑動的結果，即在DNA合成過程中，聚合酶會從模板上脫離，新合成的DNA鏈也與模板鏈發生暫時分離，并可能發生鏈的滑動，再次互補結合時形成錯配的突出環，從而使新合成的DNA鏈增加或減少一個或多個重復單位，即一步突變或幾步突變。90%以上STR基因座的突變均為增加或減少一個重復單位，即一步突變[1，9]。

本研究觀察到一步突變占比97.84%，與大多數研究[4，7，10]結果一致，余2.16%為二步以上（含二步）突變。

3.4 突變步數、等位基因片段大小的突變率、突變來源與重復單位增減的分析

一步突變與二步以上（含二步）突變中，出現重復單位增減的情況差異具有統計學意義。一步突變中，出現重復單位增加和減少的數目相當；二步以上（含二步）突變中，重復單位減少的數目明顯多于增加的數目。

關于無法明確突變等位基因片段大小的情形，突變前的兩個等位基因距突變成的新等位基因步數相同、結構相似，無法判斷突變等位基因來源；且能發生突變的兩個等位基因分別歸屬于不同長度，例如父、子、母在CSF1PO基因座的分型分別為12/14、13/13和10/13，分析孩子的13由父親的12或14突變來，而按照短中長等位基因的劃分，12屬于中等位基因，14屬于長等位基因，由于12和14距離突變后的13來說，步數相同，結構相似，都有可能是發生突變的等位基因，因此該類突變被定為無法明確等位基因長度。

突變主要發生于中等位基因，約占突變總數的83.30%（464/557），且重復序列增加與減少接近，這與文獻[4，12]的研究結果相似。短等位基因及長等位基因的突變率較低，長等位基因突變減少明顯多于增加，與多數研究[4，13]一致。

不同來源的突變出現重復單位增加與減少的比例差異具有統計學意義。父系突變出現重復單位增加與減少的比例相當，母系突變中重復單位減少明顯較增加多見。

綜上，突變是導致親代與子代不符合遺傳規律的重要原因，隨著檢測的遺傳標記越多，遇到突變的可能性也增加，因此有必要對STR基因座的突變規律及特點有所認識。本研究通過對20723例肯定親權關系的案件中觀察到的突變情況進行統計，分析了突變相關因素之間的關系以供參考。對于出現1～2個基因座不符合遺傳規律的情形，應當加測其他檢測系統，并結合突變基因座的信息計算PI值，以進一步明確鑒定意見。

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Mutation Analysis of 19 STR Loci in 20723 Cases of Paternity Testing

BI Jie1,CHANG Jing-jing2,LI Miao-xia1,YU Chun-ying1
（1.Beijing Mingzheng Forensic Identification Center,Beijing 100191,China;2.Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security,PRC,Beijing 110000,China）

ObjectiveTo observe and analyze the confirmed cases of paternity testing,and to explore the mutation rules of STR loci.MethodsThe mutant STR loci were screened from 20 723 confirmed cases of paternity testing by Goldeneye 20A system．The mutation rates,and the sources,fragment length, steps and increased or decreased repeat sequences of mutant alleles were counted for the analysis of the characteristics of mutation-related factors.ResultsA total of 548 mutations were found on 19 STR loci, and 557 mutation events were observed.The loci mutation rate was 0.07‰-2.23‰.The ratio of paternal to maternal mutant events was 3.06:1.One step mutation was the main mutation,and the number of the increased repeat sequences was almost the same as the decreased repeat sequences.The repeat sequences were more likely to decrease in two steps mutation and above.Mutation mainly occurred in the medium allele,and the number of the increased repeat sequences was almost the same as the decreased repeat sequences.In long allele mutations,the decreased repeat sequences were significantly more than the increased repeat sequences.The number of the increased repeat sequences was almost the same as the decreased repeat sequences in paternal mutation,while the decreased repeat sequences were more than the increased in maternal mutation.ConclusionThere are significant differences in the mutation rate of each locus.When one or two loci do not conform to the genetic law,other detection system should be added,and PI value should be calculated combined with the information of the mutate STR loci in order to further clarify the identification opinions.

forensic genetics;parent-child relations;short tandem repeat;DNA mutational analysis

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.010

1004-5619（2017）03-0263-04

2016-11-14）

（本文編輯：張素華）

畢潔（1983—），女，主檢法醫師，主要從事法醫物證學鑒定；E-mail：bijie0403＠163.com