1株耐高溫酸性脂肪酶產生菌的篩選鑒定與其酶學特性研究

張月月，汪燕，彭青春，羊秀美，馬振剛

(重慶師范大學 生命科學學院，重慶，401331)

1株耐高溫酸性脂肪酶產生菌的篩選鑒定與其酶學特性研究

張月月，汪燕，彭青春，羊秀美，馬振剛*

(重慶師范大學 生命科學學院，重慶，401331)

以菜籽油為唯一碳源，經過富集、馴化、平板分離初篩和復篩，從長期淤積油污的食堂下水道中篩選獲得1株脂肪酶產生菌CQNU 3-3。利用16S rDNA序列系統發育分析，結合形態學與生理生化特征確定CQNU 3-3為代爾夫特菌，并將其命名為Delftiatsuruhatensisstrain CQNU 3-3。研究發酵條件對菌株產酶的影響發現，該菌株在初始pH為2的酸性條件下，發酵酶活力最高；發酵第1天酶活力即可達到最大，發酵溫度為32～37 ℃較為適宜。對其產生脂肪酶的酶學特性進行分析，表明該酶最適反應pH為7.0，最適反應溫度為50 ℃，Cu2+、尿素、Mg2+和Na+對酶活力有顯著的抑制作用，而Zn2+和EDTA可以顯著提高酶活力。油脂降解率實驗表明該菌株對樣品中油脂的降解率可高達73.54%。

脂肪酶產生菌；篩選鑒定；耐高溫酸性脂肪酶；酶學性質；代爾夫特菌

隨著肉類、乳品等食品加工行業、油脂加工行業以及餐飲行業的發展，所排放的含油脂廢水不斷增加，這類含油脂廢水的成分往往較為復雜, 且富含有機物[1]，如果未經處理就直接排放至環境中，對自然環境將產生極大的影響[2]。對含油脂廢水的高效處理，可以大大緩解其帶來的環境壓力[3]。目前，對含油脂廢水的主要處理方法包括化學法、物理法和生物法[4]。其中，生物處理法主要是微生物在馴化選擇過程中，利用油脂作為生長所需的能源和碳源，通過所產生的脂肪酶等降解酶系使廢水中的油脂水解為脂肪酸和甘油，最后分解氧化為H2O，CO2等[5]。由于生物處理法具備應用范圍廣、簡便、能耗低、效果持久等特點，同時還具有避免化學處理法帶來的二次污染等優點[6]，因此高產脂肪酶微生物的篩選越來越受到研究者的關注。

脂肪酶已被廣泛應用于糧油食品加工、洗滌工業、生物柴油、有機合成、手性化合物合成、環境保護等方面[7-8]。其中，糧油食品加工、油脂廢水處理等諸多領域要求脂肪酶具備耐高溫、耐酸度的特點，這使得很多工業用脂肪酶在應用過程中失活，從而使得其應用受限。目前，國內對脂肪酶產生菌的研究主要集中在高產、耐堿性和耐高溫菌株的分離鑒定，而工業酸性脂肪酶的來源主要還是進口，因此，篩選耐高溫酸性脂肪酶產生菌，并對其發酵及酶學特性進行分析，可為工業化生產耐高溫酸性脂肪酶奠定基礎[9]。至今，脂肪酶產生菌的篩選樣本主要來源于長期淤積油脂的下水道[10]、長期受油脂污染的土壤[11]、生活用水排污口[12]、含油污泥的堆肥[13]等。本研究利用分子生物學鑒別法結合常見細菌鑒定法鑒定了1株從長期淤積油污的食堂下水道分離獲得的菜籽油降解細菌CQNU 3-3；通過馴化與多次傳代后，對該菌株的產酶發酵條件、酶的最適反應條件和對油脂的降解率進行了研究，這為其進一步的開發利用研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源

含油脂廢水樣品取自重慶師范大學(大學城校區)學生第二食堂下水道，分3點取樣，每點50 mL。

1.1.2 培養基

(1)富集培養基(g/L)：蛋白胨 5.0 g，酵母粉2.5 g,葡萄糖10 g，菜籽油2.5 g，Tween-80 3.0 g，加蒸餾水定容至500 mL,121 ℃高溫滅菌20 min。

(2)馴化培養基(g/L)：K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，NaHPO40.5 g，NaCl 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，菜籽油2.5 g，pH自然，加蒸餾水定容至500 mL,121 ℃高溫滅菌20 min。

(3)選擇性平板培養基(g/L)：(NH4)2SO40.25 g，K2HPO40.15 g，NaCl 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，酵母粉0.25 g，瓊脂 10.0 g，吐溫-80 6.0 g，菜籽油5.0 g，pH 7.0，加蒸餾水定容至500 mL, 121 ℃高溫滅菌20 min，制備成平板。

(4)發酵培養基(g/L)：(NH4)2SO41.0 g，K2HPO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaCl 1.0 g，菜籽油 5.0 g，pH 7.0，加蒸餾水定容至500 mL, 121 ℃高溫滅菌30 min，備用。

(5) LB培養基：蛋白胨1.0 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL，121 ℃高溫滅菌30 min，備用。

1.1.3 實驗試劑

95%酒精，1%酚酞，0.05 mol/L NaOH，0.05%石油醚，菜籽油，4%聚乙烯醇。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理

采集獲得的含油脂廢水，加入適量無菌水，搖勻，3層紗布過濾收集，備用。

1.2.2 菌種的富集培養

取25 mL過濾樣品，接種于含150 mL富集培養基的三角瓶中，置于30 ℃，150 r/min恒溫搖床培養72 h。

1.2.3 馴化培養

取25 mL富集培養后的菌液，接種于含150 mL含菜籽油5.0 g/L馴化培養基的三角瓶中，置于37 ℃，150 r/min的恒溫搖床上培養。4 天為1個周期，馴化培養28天，每個周期結束后將馴化菌液接種至含油量遞加5.0 g/L的馴化培養基中進行培養。

1.2.4 篩選平板初篩

主要采用吐溫-80篩選法：取1 mL馴化培養后的菌液，加入9 mL滅菌蒸餾水中，混勻；隨后吸取0.1 mL涂布于選擇性平板培養基(含吐溫-80)上，置于37 ℃培養72 h，觀察菌落的生長情況及降解圈的大小。

1.2.5 篩選平板復篩

從初篩的選擇性平板基中選取抑菌圈直徑與菌落比較大的菌株進行多次重復劃線分離，置于37 ℃培養72 h直至得到純菌株。挑取純化的菌株至LB液體培養基中，置于37 ℃，150 r/min搖床中至搖勻渾濁，存于4 ℃備用。

1.2.6 菌株的形態學與生理生化特征分析

取CQNU 3-3菌種在LB固體培養基上劃線，隨后將平板放入37 ℃恒溫培養箱內倒置培養，待菌落長出后觀察菌落特征，包括形狀、大小、顏色、光澤、表面狀況、質地以及是否分泌色素等特征。生理生化特征分析主要參照伯杰氏細菌鑒定手冊進行。

1.2.7 菌株的16S rDNA序列分析

對所挑選的菌株進行菌落以及細胞形態觀察后，擴大培養，以16S rDNA通用引物進行菌液PCR，PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，PCR循環數：32次，72 ℃溫育 10 min，4℃保存。切膠回收16SrDNA片段，并送至公司測序。獲取序列后，使用NCBI的在線BLAST工具對其進行同源序列比對，并利用MEGA6構建系統發育樹。

1.2.8 脂肪酶產生菌產酶活性檢測與分析

1.2.8.1 脂肪酶產生菌的初步發酵

取2 mL的 LB培養基菌液接至100 mL發酵培養基中，置于37 ℃，150 r/min的恒溫搖床上培養24 h。然后使用離心機3 000 r/min 離心10 min，取上清液測定脂肪酶活力，即可以獲得脂肪酶產生菌CQNU 3-3初步發酵后發酵液中的酶活力。

1.2.8.2 脂肪酶產生菌的堿滴定法測定酶活

(1)取4個100 mL錐形瓶，進行空白對照和平行重復實驗。分別加入底物溶液4 mL和NaHPO4-KH2PO4緩沖液5 mL，再向空白對照瓶中加入95%乙醇15 mL，于40 ℃水浴鍋中預熱5 min，然后實驗組中各加入1 mL上清酶液，空白對照瓶中加入1 mL蒸餾水，立即混勻計時。40 ℃水浴15 min后，向實驗組中補加15 mL酒精終止反應，取出。

(2)向4個錐形瓶中分別加入2～3滴酚酞，用NaOH標準溶液滴定，直至呈現微紅色，并保持30 s不褪色，即為滴定終點，紀錄消耗NaOH標準溶液的體積[14]。

(3)酶活力按公式(1)計算：

(1)

式中：Y，樣品的酶活力，U/mL；V1，滴定樣品時消耗NaOH標準溶液的體積，mL；V2，滴定空白時消耗NaOH標準溶液的體積，mL；c，NaOH標準溶液濃度，mol/L；50，0.05 mol/L NaOH溶液1 mL相當于脂肪酸50 U/mol；n，樣品的稀釋倍數；0.05，NaOH標準溶液濃度換算系數；15，反應時間15 min，以1 min計算。

(4)每個實驗條件下計算獲得3組平行實驗數據，使用SPSS11.0軟件對不同實驗條件下所獲取的數據進行T檢測，分析數據差異是否具有統計學意義。

1.2.8.3 油脂降解率的測定

根據菜籽油對光的吸收特性，采用722S可見分光光度計測定樣品在355 nm波長下的吸光度值，同時以菜籽油為溶質，石油醚為溶劑，測定不同菜籽油質量濃度的吸光度值。以0.01 g/mL菜籽油的石油醚溶液，分別取0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mL，加石油醚至標線，混勻，以零濃度為對照，在355 nm波長下測量吸光值，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=1.093 3x+0.002 0，R2=0.981 2。根據標準曲線計算菌株的油脂降解率[15]。

2 結果與討論

2.1 脂肪酶產生菌的分離與篩選

收集到的含油脂廢水樣品按方法所述進行稀釋，涂布到選擇性平板培養基的平板上，37 ℃培養72 h，以菜籽油為唯一碳源進行培養與篩選，結果如圖1A所示，共分離獲得6株不同的脂肪酶產生菌，其中菌株CQNU 3-3的乳白色圈和直徑比最大，達到6∶1。將其在含有吐溫-80的選擇性培養基上反復篩選純化，見圖1B。觀察其菌落較小，中間突起，邊緣不規則，表面光滑，不分泌色素。

圖1 脂肪酶產生菌的初篩(A)與CQNU 3-3菌株的純化(B)Fig.1 Screening of and re-screening of lipid degrading strains (A) and purification of CQNU 3-3 strain

2.2 CQNU3-3菌株的鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

對CQNU3-3菌株進行淀粉水解、葡萄糖發酵等生理生化實驗，結果如表1所示。生理生化實驗分析表明，CQNU 3-3菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為稍彎曲的短桿狀，不能利用葡萄糖、蔗糖，不水解淀粉，七葉苷實驗、乙酰甲基甲醇試驗(V-P實驗)和甲基紅(M.R)反應呈陰性，接觸酶實驗、尿素分解實驗、油脂水解實驗反應呈陽性。各項生理生化指標結果與代夫特菌屬的代表種一致。

表1 CQNU3-3菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of CQNU 3-3 strain

“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.2.2 16S rDNA序列鑒定

采用細菌16S rDNA基因的PCR通用引物進行CQNU3-3菌株的16S rDNA基因的擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示獲得單一的DNA條帶，分子量約為1.6 kb，結果如圖2A所示。

將獲取的PCR產物進行測序，獲得1條1 497 bp的16S rDNA序列。使用NCBI在線BLAST工具進行基因的多重序列比對分析。結果表明，CQNU 3-3菌株的16S rDNA序列與Delftiatsuruhatensisstrain Cl-23的16S rDNA序列同源性最高，達到99%。系統發育分析所需的基因序列從Genbank中下載獲得，使用Cluster X軟件對序列進行多重序列比對，使用MEGA6軟件中的Neighbor-Joining法對序列進行系統發生分析，采用Bootstrap方法1000 個重復進行可靠性檢驗(見圖2B)。結果表明，CQNU 3-3菌株與Delftiatsuruhatensisstrain Cl-23進化關系最近。

A-16S rDNA的PCR擴增；B-16S rDNA序列的系統發育分析圖2 CQNU3-3菌株的16S rDNA序列分析Fig.2 Sequence analysis of 16S rDNA of CQNU 3-3 strain

綜上分析表明，CQNU 3-3的菌落形態、生理生化特性與代爾夫特菌屬一致，16S rDNA基因序列與Delftiatsuruhatensis的同源性達到99%，系統發育分析表明其與Delftiatsuruhatensis的進化關系最近。因此，確定CQNU 3-3菌株為代爾夫特菌(Delftiatsuruhatensis)，命名為Delftiatsuruhatensisstrain CQNU 3-3。目前，已報道的產脂肪酶微生物約來自于65個屬[16]，但尚未發現關于Delftiatsuruhatensis菌降解菜籽油的報道。代爾夫特菌屬(Delftia)是新建立的一個菌屬，屬于變形菌β亞綱、從毛單胞菌科[17]。目前已經發表的種包括食酸代夫特菌、湖生代夫特菌和Delftiatsuruhatensis。其中食酸代夫特菌研究于臨床，為人類少見的機會致病菌[18]。

2.3 發酵條件對CQNU3-3菌株產酶活力的測定

2.3.1 發酵時間對產酶活力的影響

配制發酵培養基，置于37 ℃，150 r/min的恒溫搖床上分別培養1、2、3、4、5 d。獲得的粗酶液在pH 7.0的磷酸緩沖液，40 ℃的水浴鍋中反應，測定不同發酵天數對脂肪酶活力的影響，見圖3A。結果表明，當發酵在第1～3天時，酶活力較好；發酵第3天以后酶活力急劇下降。因此，CQNU 3-3菌株的發酵時間應控制在3天以內。

2.3.2 發酵pH對產酶活力的影響

調節不同初始pH值的發酵培養基，置于37 ℃，150 r/min的恒溫搖床上培養24 h。獲得的粗酶液在磷酸緩沖液pH=7.0，40 ℃的水浴條件下進行酶活測定，分析不同發酵pH值對酶活力的影響，見圖3B。當初始發酵培養基的pH為2時，產酶活力最高；當pH=11時，酶活力最低。因此，CQNU 3-3菌株表現出較強的耐酸性，其對極堿性條件的耐受能力較弱。其耐酸性水平，與經誘變選育后的酸性脂肪酶產生菌相當[9]，這表明CQNU 3-3菌株可作為誘變育種的良好素材，其具有一定的應用開發潛力。

2.3.3 發酵溫度對產酶活力的影響

分別在不同溫度的搖床上發酵培養24 h，粗酶液在磷酸緩沖液pH=7.0，40 ℃的水浴條件下反應， 測定不同發酵溫度對產酶活力的影響，如圖3C所示。結果表明，發酵溫度為32～37 ℃時，酶活力都較好；發酵溫度高于42 ℃時酶活力下降顯著。

圖3 發酵條件對CQNU3-3菌株產酶活力的影響Fig.3 Effects of fermentation conditions on enzyme activity of CQNU3-3 strain

2.4 反應條件對CQNU3-3菌株的脂肪酶活力的影響

2.4.1 溫度對酶活力的影響

取發酵培養24 h后離心收集的上清液作為粗酶液，保持pH=7.0的反應pH， 調節反應溫度， 測定不同溫度對脂肪酶活力的影響，如圖4A所示。該酶最適反應溫度為50～60 ℃，且在溫度高達70 ℃時，仍保留約55%的脂肪酶活力。而前人報道的脂肪酶產生菌的最適反應溫度主要在28～45 ℃[19-20]，這表明該酶具有較寬的溫度適用性。

2.4.2 pH對酶活力的影響

取發酵培養24 h后離心收集的上清液作為粗酶液，調節不同的磷酸緩沖液的pH值，在40 ℃的水浴條件下反應，測定不同pH對脂肪酶活力的影響，見圖4B。該脂肪酶的最適反應pH為7.0；另外，該酶在酸性條件pH=6.0時仍能保持66%左右的酶活力；而在pH達到8.5的堿性條件下，也保留了約60%的酶活力，這表明該脂肪酶在較酸和較堿條件下，均具有較好的反應活性。

2.4.3 離子與添加物對酶活力的影響

取發酵培養24 h后離心收集的上清液作為粗酶液，在40 ℃下反應，分別配制含有各種離子的反應緩沖液，測定不同pH對脂肪酶活力的影響，見圖4C。Zn2+、EDTA對酶活力有顯著的促進作用，而Mg2+、Cu2+、尿素、Na+對酶活力有顯著地抑制作用。K+和Ca2+對酶活力沒有顯著的影響。該菌株對EDTA的耐受性，暗示其在食品加工業及洗滌工業廢水處理過程中有良好的應用前景。

圖4 反應條件對CQNU3-3菌株脂肪酶活力的影響Fig.4 Effects of reaction conditions on lipase activity of CQNU3-3 strain

2.5 油脂降解率分析

將篩選到的菌株接種到選擇培養液中，置于37 ℃，150 r/min恒溫搖床培養6 d。測定含油量，根據菜籽油標準曲線計算油脂降解率，結果表明該菌株對樣品中油脂的降解率達到73.54%。

3 結論

本研究通過對長期淤積油脂的食堂下水道內廢水中的微生物進行富集、馴化、分離培養，篩選得到1株耐高溫酸性脂肪酶產生菌株CQNU 3-3，通過對其進行菌落形態學特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，鑒定其為代爾夫特菌屬(Delftia)的Delftiatsuruhatensis。研究結果顯示，菌株CQNU 3-3發酵時間在1～3 d時酶活力最佳，到第3天后酶活力急劇下降；發酵培養基初始pH為2時酶活力最高，而當pH為11時幾乎沒有酶活力；發酵初始最適溫度可以控制在32～37 ℃，這表明菌株能夠在較低溫度與酸性條件下發酵產酶；菌株CQNU 3-3分泌的脂肪酶酶活力最適pH=7.0，同時在酸性和堿性條件下均能保留60%左右的酶活力；酶反應最適溫度為50～60 ℃，表明該酶能夠在較酸和較堿性，以及較高溫度下保持較高酶活力，篩選獲得1株性狀優良、適合糧油食品加工、洗滌工業污水處理和醫藥生產等行業需求的耐高溫酸性脂肪酶產生菌株具有一定的應用價值。同時，發現在搖床轉速為150 r/min，37 ℃下培養6 d，該菌的油脂降解率達73.54%。經10次傳代后，菌株的油脂降解能力穩定存在，這暗示其具有應用于環境與食品工業等領域的潛力，可為生物法處理含油脂廢水，食品加工工藝等提供有用的菌株資源。

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Screening,identificationandcharacterizationsofathermostableacidlipasestrain

ZHANG Yue-yue,WANG Yan,PENG Qing-chun,YANG Xiu-mei,MA Zhen-gang*

(College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

Using rapeseed oil as the only carbon source, a thermostable acid lipase strain CQNU 3-3 was isolated from the sewage of the school dining hall through enrichment, domestication, screening and re-screening. The analysis of morphology, physiological and biochemical characteristics, the phylogeny of 16S rDNA sequence indicated that the strain CQNU 3-3 was as a member ofDelftiatsuruhatensisand namedDelftiatsuruhatensisstrain CQNU 3-3. The analysis on the effects of fermentation conditions to the production of enzyme showed that the enzyme activity was the highest at the initial pH 2, the suitable fermentation temperature was 32-37 ℃. The study on enzymatic properties of lipase showed that the optimum reaction pH was 7.0, the reaction temperature was 50 ℃. Zn2+and EDTA could significantly increase the enzyme activity and Cu2+, Mg2+, Na+and urea could significantly decrease the enzyme activity. Additionally, the degradation rate of the added oil in the sample was high to 73.54%.

lipase-producing bacterium; screening and identification; thermostable acid lipase; enzyme characterization;Delftiatsuruhatensis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014944

碩士研究生(馬振剛副教授為通訊作者,E-mail：mzgcqnu@126.com)。

重慶市教委科學技術研究項目(KJ1500325)

2017-06-12，改回日期：2017-06-25