蛋白質及多肽作為水產品抗凍劑的應用及其機理

劉建華，蘇琦，羅亞洪，劉書來，丁玉庭

(浙江工業大學 海洋學院，浙江 杭州，310014)

蛋白質及多肽作為水產品抗凍劑的應用及其機理

劉建華，蘇琦，羅亞洪，劉書來，丁玉庭*

(浙江工業大學 海洋學院，浙江 杭州，310014)

水產品營養豐富易于消化，深受人們的喜愛，并且產量巨大，一般通過冷凍方式對其進行貯藏。但是由于水產品中水分和蛋白質含量很高，在凍藏過程中，易發生冷凍誘導變性，造成品質劣變。目前添加抗凍劑是有效緩解品質劣變的方法之一，已被研究出的抗凍劑有糖類、多聚磷酸鹽、水溶膠、蛋白質及多肽等。文中探討了水產品的冷凍變性機理，結合國內外研究重點綜述了蛋白質以及多肽作為抗凍劑的應用效果，并且探討了其作用機理。

冷凍變性；蛋白質；多肽；冷凍貯藏；抗凍劑

我國是盛產水產品的大國，連續20多年，我國的水產品產量位居世界第一。水產品具有高蛋白、低脂肪的特點，深受人們的青睞[1]，同時水產品的水分含量較高，在捕撈后的運輸和貯藏過程中，由于皮膚組織比較脆弱易受微生物污染且體內含有大量活性較強的酶，使得蛋白質、氨基酸、脂肪酸等成分易發生分解，所以非常容易腐爛變質從而導致品質劣變[2]。因此，為了保證水產品在使用前的新鮮度，捕撈后立即對其進行冷藏或凍藏保鮮便顯得尤為重要。在凍藏過程中，水產品會發生一系列的物理化學變化，導致體內蛋白質發生不同程度的變性，而肌肉蛋白變性后，會導致水產品內部組織纖維化，使其在食用時肉質纖維化，失去彈性和原有的鮮味，甚至由于變質而失去食用價值[3]。

目前，添加抗凍劑是有效緩解水產品在冷凍保藏過程中品質劣變的方法之一，常用的傳統抗凍劑是 4% 蔗糖和 4% 山梨糖醇，同時混合一定量的多聚磷酸鹽[4]。LIU等[5]通過實驗將蔗糖和山梨糖醇以質量比1∶1的混合物加入到鯉魚魚糜中，可以有效地防止魚糜中羰基化合物的形成，抑制了肌原纖維蛋白的冷凍變性。然而，由于蔗糖的甜度高，熱量大，會對一些肥胖、高血糖以及患有糖尿病人群產生不利的健康影響，從而限制了消費人群。另外，盡管高濃度的糖可以使產品內部的水分在冷凍貯藏過程中形成微小的冰結晶，但是，當貯藏溫度波動時，冰結晶的微小結構融化后會發生重結晶，冰晶的尺寸會較快地增長，從而產生負面的紋理特征[6]。所以綜合考慮其使用效果并不是非常明顯，并且攝入過多的磷酸鹽會影響人體對鈣質的吸收[7]。因此，對新類型抗凍劑如低聚糖類、蛋白水解物、酶解物、多元醇和鹽類等的抗凍作用已成為近年來研究的熱點[8]。有研究表明，食品蛋白質水解物多肽，特別是海鮮加工副產物中的衍生多肽，可以有效地抑制水產品在冷凍過程中發生的肌肉蛋白質變性，抗凍效果可與傳統抗凍劑相媲美，并且改善了傳統抗凍劑甜度高的缺點，使得這些副產物得到充分利用[9]。本文根據近年來國內外研究的最新進展，綜述了蛋白質及多肽作為水產抗凍劑的應用與作用機理，為進一步研究蛋白型抗凍劑提供理論依據。

1 水產品的冷凍變性機理

關于水產品蛋白質冷凍變性機理的說法有很多種，主要有以下3種：(1)結合水脫離變性學說，水產品在凍藏時，由于肌肉組織中的結合水與蛋白質分子結合牢固，自由水首先會被凍結，隨著溫度的降低和凍結時間的延長，凍結率提高使得部分結合水也被凍結，蛋白質分子中的側鏈在冰晶的作用下靠攏、聚集，從而使蛋白質發生變性[9]。(2)水和水合水的相互作用學說，由于水在形成冰晶時體積膨脹產生內應力，冰晶之間的擠壓作用使蛋白分子中部分化學鍵斷裂[10]，如二硫鍵、氫鍵、疏水鍵、鹽鍵及靜電相互作用等次級鍵，部分化學鍵重建，這些化學鍵的斷裂與重建使蛋白質分子的空間結構遭到破壞[11]，另外，冰晶的形成與增長會對肌原纖維蛋白產生機械損傷，引發蛋白質變性。(3)細胞液的濃縮理論，凍結過程中自由水形成冰晶，冰晶析出會導致肌肉細胞液濃縮，使細胞中的鹽濃度升高和pH值改變，從而引發魚肉蛋白質變性[13]。

許多魚類含有豐富的不飽和脂肪酸，凍藏過程中會氧化降解，產生低級的有害物質如醛、酮等，這些有害物質會引發蛋白質同脂質的交聯作用[12]，另外海水魚中含有氧化三甲胺酶，它會促使氧化三甲胺被還原成三甲胺，同時也產生相當數量的甲醛和二甲胺，以及三磷酸腺苷降解生成的嘌呤類物質等，均可能導致蛋白質的冷凍變性[14]。

2 抗凍劑的作用機理

研究表明，抗凍劑可被用作保護性材料[15]，緩解水產品在凍藏過程中蛋白質分子間次級鍵與二硫鍵間的聚集，減小蛋白溶解性的損失，抑制Ca2+-ATPase的活性以及延緩表面疏水基團和巰基的迅速暴露[16]。廣泛使用的抗凍劑有糖類、多聚磷酸鹽、水溶膠等。糖類分子中的羥基可以與蛋白質分子的某些基團發生反應，避免蛋白質分子之間的聚集變性，并且可以改變包埋在蛋白質分子中結合水的狀態[17]，取代蛋白質分子表面的結合水而與之結合，起到抑制蛋白質變性的效果。譚昭儀等[18]用山梨糖醇、蔗糖、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl等復配成新型蛋白抗凍劑，添加到鳙魚魚糜中，較好地維持了冷凍后魚糜的凝膠強度、破斷強度和凹陷深度，有效抑制了魚糜在凍藏期間的冷凍變性。將傳統抗凍劑與多聚磷酸鹽復配，首先可以調節水產制品的pH值，其次，多聚磷酸鹽的添加可以提高肌肉體系的離子強度使其偏離等電點，使得電荷相互排斥，蛋白質之間產生更大的空間，進而可以提高肌肉組織的保水性，防止蛋白質變性[19]，并且多聚磷酸鹽可以螯合Ca2+和Mg2+以及解離肌球蛋白和肌動蛋白，但單獨使用多聚磷酸鹽的抗凍效果不明顯[9]。

CAO等[21]研究出改性淀粉蔗糖混合物可以抑制肌原纖維蛋白在長期冷凍貯藏過程中的構象改變并提高冷凍魚糜凝膠強度。在冷凍時，冰晶的形成會破壞蛋白質結構，添加多糖后，多糖一方面可以排除蛋白質表面的穩定溶質，促使其優先水合[20]，另一方面可以與蛋白質的功能基團以離子鍵或者氫鍵的形式結合，取代極性基團附近的水分子，避免氫鍵連接點的直接暴露，進而穩定蛋白質的高級結構[22]。ZHOU等[23]將海藻糖和乳酸鈉加入到羅非魚魚糜中，能夠有效地維持Ca2+-ATPase活性和蛋白質溶解度以及抑制蛋白質表面疏水性的增加，海藻糖分子中的羥基能夠與蛋白質分子的某些基團發生反應，從而避免蛋白質分子之間的聚集變性，并且可以抑制肌原纖維蛋白構型的變化，防止活性巰基的暴露，抑制凍藏過程中巰基氧化和二硫鍵的形成[15]。曹湛慧等[24]將卡拉膠、麥芽糊精、蔗糖酯與傳統魚糜抗凍劑進行復配，通過正交試驗優化得到一種金鯧魚冷凍魚糜的新型復配抗凍劑，研究得出卡拉膠可以使冷凍魚糜形成更穩定、致密和均勻的三維網狀結構，從而使水分有效地保留在凝膠網狀結構中，麥芽糊精能有效的阻止魚肉肌原纖維蛋白的變性，在一定程度上保護肌球蛋白結構的穩定，因此對魚糜蛋白的冷凍變性具有良好的抑制作用[25]，同時也較好地維持了冷凍魚糜的功能特性。

3 蛋白質及多肽作為抗凍劑的應用

3.1 蛋白質類抗凍劑

研究表明，在冷凍魚糜中添加一些蛋白類物質如乳清蛋白及其衍生物等可以有效地提高魚糜的抗凍性能[26]。畢海丹等[27]研究發現0.05% 茶多酚和5% 乳清蛋白聯合使用，顯著抑制巰基氧化成二硫鍵(p<0.05)，有效延緩魚糜在冷藏過程中肌原纖維蛋白的變性和降解，抑制油脂氧化，乳清蛋白顯著提高草魚魚糜的凝膠強度(p<0.05)，其中茶多酚在抑制油脂氧化方面起到更主要的作用。乳清蛋白作為抗凍劑使用，主要原因是乳清蛋白的溶解性和乳化性等會改變蛋白質的水合狀態，并通過氫鍵生成的乳蛋白-魚蛋白復合物能夠阻礙魚肉蛋白分子間的聚集和水分子的脫離，從而抑制魚肉蛋白的變性[14]。LI等[15]將傳統抗凍劑和乳清蛋白水解物添加到鯉魚魚糜中冷凍貯藏，研究發現魚肉蛋白表面疏水性和濁度均有上升趨勢，而總巰基含量的增長速度、Ca2+-ATPase活性以及蛋白質溶解度和蛋白質熱穩定性均明顯下降(p<0.05)。乳清蛋白水解產物的抗凍效果歸因于能夠防止脂質中氧化引發劑的產生，并且直接清除活性自由基，避免肌原纖維蛋白結構的改變。因此，傳統抗凍劑和乳清水解物的結合具有抑制魚糜脂肪氧化和保護魚糜蛋白質結構的雙重效果[28]。

3.2 多肽類抗凍劑

3.2.1 明膠水解物

3.2.1.1 雞皮明膠水解物

多肽中大量氨基酸含有暴露的羥基，這部分羥基能夠與水相互作用形成氫鍵，保證了凍結過程中水的穩定性，避免蛋白質空間構象的劇烈變化[29]。在凍融循環過程中，抗凍劑與蛋白質周圍水分子的相互作用會影響冰晶的數量和形狀[30]，隨著溫度的升高，細小的冰晶全部融化，由此產生的水分在冷卻階段，會優先向較大的冰晶體表面擴散，而不是形成新的冰核。因此，凍融循環后，產品中冰晶的數量減少體積增加，從而機械性破壞蛋白質結構導致蛋白質變性。這與DU等[6]研究反復凍融蔗糖模型系統所觀察到的冰晶變化一致，蔗糖模型系統中添加雞皮明膠水解物(chicken collagen hydrolysate，CCH)后，研究發現該水解物可以通過氫鍵作用結合到冰晶表面，控制再結晶過程中冰晶體積的增加，使融化后得到的水分重新形成細小的冰晶[31]。從雞皮明膠水解物中得到三肽重復序列(-Gly-X-Y-)，其中X和Y可能是脯氨酸或羥脯氨酸，富含脯氨酸殘基的烷基側鏈可以提供部分非極性環境，通過疏水相互作用以穩定多肽和冰晶之間形成的氫鍵，能夠對抗冰水之間氫鍵相互作用，使之顯著抑制冰晶的生長速率(p<0.05)，從而防止蛋白質變性(如圖1)[32]。DU等[33]又將雞皮明膠水解物添加到天然肌動球蛋白(natural actomyosin，NAM)模型系統中，通過偏光顯微鏡觀察出天然肌動球蛋白中的冰晶形成過程與上述觀點相符合。研究表明，雞皮明膠水解物可以降低冰晶的生長速率，經過幾次凍融循環后，有效抑制了較大冰晶的形成(如圖2)，并且得到的蛋白質溶解性更高，消化性和凝膠結構更好。

圖1 抗凍多肽與冰結構分子表面形成氫鍵的模型(引自汪少蕓[32])Fig.1 Model of hydrogen bonds between antifreeze peptide and the surface of ice molecules

圖2 抗凍劑對天然肌動球蛋白中冰晶生長的效果示意圖 (引自DU[33])Fig.2 A possible schematic illustration of the effect of cryprotectants (CCH) on ice growth in NAM structures during freeze-thaw cycles

3.2.1.2 魚皮明膠水解物

大量的研究表明明膠水解物可以阻止不同水分子之間的位移，從而穩定在反復凍融過程魚肉肌原纖維中的水分。NIKOO等[34]通過研究得出魚皮明膠水解物具有抑制脂肪氧化，阻止蛋白質羰基化合物形成和降低總巰基含量損失的作用。魚肉中添加魚皮明膠水解物后，肌球蛋白顯示出更高的轉變溫度和熱焓。該明膠水解物含有序列為-Pro-Ala-Gly-Tyr-的四肽結構，可以清除活性自由基，ABTS自由基和無金屬螯合活性的羥基自由基，抑制魚糜脂肪氧化[35]，保護總巰基含量以及降低蛋白質羰基化，減少自由水的形成，在凍融循環過程中有效的保護魚肉品質[36]。

KITTIPHATTANABAWON等[37]從黑鰭鯊魚魚皮中提取出明膠水解產物，加入到金線魚魚糜中進行凍融循環，結果表明冷凍魚糜中Ca2+-ATP酶活性、總巰基含量、全天然肌動蛋白溶解度都隨著凍融循環次數的升高而降低，表面疏水性增大，二硫鍵含量升高，當加入水解度為10%的明膠水解產物時，Ca2+-ATP酶活性最高，表面疏水性最低，二硫鍵含量升高速率降低，說明水解度10% 的明膠水解產物抑制魚糜蛋白變性效果最好。這與LIMPISOPHON等[38]水解鯊魚皮明膠和牛皮明膠得到的水解產物添加到魚糜中，抑制肌原纖維蛋白結構聚集的結果類似。KARNJANAPRATUM等[39]從單角革鲀皮膚中獲取的明膠水解產物，發現自溶非膨脹皮膚水解物具有更高的鹽溶性蛋白抗凍性能，并且明膠水解產物可抑制天然肌動球蛋白的物化變化，以及顯著降低Ca2+-ATP酶活性、表面疏水性和二硫鍵的形成(p<0.05)。經過差示掃描量熱分析，顯示肌球蛋白和肌動蛋白有更高的熱焓，可以抑制脂類氧化。單角革鲀皮膚明膠水解物含有高比例的親水性氨基酸，具有制約較低的水分遷移到冰核上形成大冰晶的作用[9]。

3.2.2 魚肉蛋白質水解物

近年來，隨著水產綜合利用的深入研究，水產加工下腳料得到充分利用。與傳統抗凍劑相比，YANAN[40]在草魚魚糜中添加鰻魚頭部蛋白水解物，-20 ℃貯藏80 d，Ca2+-ATP酶活性顯著下降(p<0.05)，魚糜中鹽溶性蛋白含量高于未添加水解物的樣品，表明鰻魚頭部蛋白水解物可以抑制草魚魚糜蛋白變性。林嫻萍等[41]研究鮐魚肉酶解物添加量對凍藏帶魚魚糜抗冷凍變性效果的影響，發現鮐魚肉酶解物合適的添加量為5%～7%時，帶魚魚糜所表現出來的抗凍效果最好，不但延緩肌原纖維蛋白溶解度、活性巰基含量的下降速度，而且還提高魚糜保水性。鮐魚肉酶解物所含的親水氨基酸與水作用形成氫鍵，可促進自由水轉化為束縛水，減少冰晶體形成量，減緩蛋白分子的相互聚集，防止蛋白質凝聚變性。 此結果與CHEUNG等[43]酶解太平洋鱈魚魚肉得到魚蛋白水解物，以及KORZENIOWSKA等[42]在天然肌動球蛋白(NAM)中添加魚蛋白水解物，研究其在冷凍魚糜中的抗凍效果一樣。這些魚肉蛋白水解物中含有高濃度的游離氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和賴氨酸等，帶負電荷的谷氨酸和天冬氨酸借助陰離子基團與蛋白形成復合物，使蛋白分子表面覆蓋許多負電荷，這些負電荷在蛋白分子間產生排斥力，避免蛋白質聚集，抑制蛋白變性從而具有冷凍保護作用[44]。

3.2.3 其他蛋白質水解物

除了以上乳清蛋白、明膠蛋白水解物和魚類蛋白水解物外，RUTTANAPORNVAREESAKUL[45]還利用蝦的邊角料，在蜥魚魚糜中添加蝦頭蛋白水解物，用來抑制肌原纖維的冷凍誘導變性，以及研究3種不同種類的蝦頭蛋白水解物對魚糜的凝膠形成能力和蛋白質變性的影響。結果顯示，魚糜中添加5%干物質和谷氨酸鈉，-25 ℃條件下貯藏80 d后，殘留的Ca2+-ATP酶活性與魚糜凝膠強度都比空白對照組高，并且與蝦的種類無關，未凍結水的含量也增加了1.29～1.36倍。研究表明肌原纖維蛋白和蝦頭蛋白水解物的活性成分之間的相互作用，如親水氨基酸和肽，可以延緩冷凍魚肉肌原纖維的變性[46]。

另外，陳日春[47]研究了酶解得到鰱魚魚鱗膠原蛋白產物，實驗證明該膠原蛋白產物具有抗氧化性。WU等[48]在草魚魚糜中加入絲膠酶肽，研究對魚糜的冷凍誘導變性影響。結果顯示，絲膠酶肽含有很高的極性氨基酸以及含大量羥基側鏈的氨基酸，可以有效降低總巰基含量，減緩蛋白質表面暴露包埋疏水殘基的速度。丁一[49]從豬骨中得到骨蛋白水解物，與魔芋粉復配后加入到鯉魚魚肉中，其水解產物與魔芋粉的最佳添加量分別為4%和0.5%。研究表明，骨蛋水解物和魔芋粉可以保護蛋由質，延緩其發生變性。骨蛋白水解與魔芋復配后，其抗凍效來明顯好于含量為50%的傳統抗凍劑，其提高色肉肌原纖維蛋白乳化特性和凝膠特性的能力甚至優于含量為100%傳統抗凍劑，并且克服了傳統抗凍劑降低魚肉鮮味和色澤及高甜度、高熱量的不足。

4 結論與展望

隨著科技的發展，我國對于水產品抗凍劑的研究已經取得了較大進展，但與世界發達國家相比，仍存在較大差距。傳統的抗凍劑效果明顯容易獲得，但是由于甜度和熱量高，影響了魚糜及其制品的口味和健康營養價值，不符合現代生活中人們對健康飲食的追求，所以積極研究新型抗蛋白冷凍保護劑非常必要。前人的研究表明，蛋白質及多肽作為水產抗凍劑已經取得明顯的效果，并且克服了傳統抗凍劑自身的缺陷，總結得出一般具有抗凍效果的物質往往分子質量相對較小，具有—COOH或—OH 必須基團及1個以上—COOH、—OH或—SH 等輔助基團，且基團分布合理，如一些小分子的糖和糖醇、氨基酸或羧酸類物質常表現出抗蛋白變性活性[41]，這些物質與水作用形成氫鍵，增強凍結過程中水的穩定性，減少巨大冰晶體的形成，較好地維持了蛋白質的凝膠形成能力、保水能力和溶解性等功能特性，利用復合酶水解工藝可進一步將蛋白質和游離多肽分解成更小分子物質，對天然抗凍劑的研發具有重要意義。不過，魚肉蛋白質種類及含量不同，在冷凍過程中的變性效果也可能不同，故繼續探明蛋白質冷凍變性與分子之間的作用機理，建立水產蛋白冷凍變性的防御體系不可或缺，其次，多肽類抗凍劑種類繁多，獲取途徑眾多難以選擇，對水產品凍藏后的口感及加工性能影響還有待研究。本綜述將為蛋白質及多肽類抗凍劑在食品領域的廣泛應用提供依據。

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Applicationandmechanismsofproteinsandpolypeptidesascryoprotectantsinaquaticproducts

LIU Jian-hua,SU Qi,LUO Ya-hong,LIU Shu-lai,DING Yu-ting*

(Ocean College,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

Aquatic products are consumers’ favorite products due to its nutrients and easy digestion. However, aquatic products are easy to deteriorate because of their higher water and protein content. The protein denaturation occurs frequently during frozen storage. Cryoprotectant is considered to be one of the most effective ways to prevent frozen aquatic products from protein denaturation. The cryoprotactants, such as saccharides, polyphosphates, hydrosol, proteins and hydrolysates have been widely studied. This study elaborated the denaturation mechanism of aquatic products. The relevant studies around the world and the application of proteins and polypeptides as cryoprotectants were discussed. The underlying mechanisms of cryoprotective effect were elucidated. This study provides a theoretical guidance for novel protein cryoprotectants.

frozen denaturation; protein; polypeptide; frozen storage; cryoprotectants

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014002

博士，副教授(丁玉庭教授為通訊作者,E-mail：dingyt@zjut.edu.cn)。

2017-02-08，改回日期：2017-04-14