坑道噪聲性聽力損失易感者血清差異表達蛋白的篩選及鑒定△

段富家 張延平 李麗娜 蔣興旺 劉金偉 肖林

噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss, NIHL)是人們在長期接受噪聲刺激后而發生的漸進性感音神經性聽力損失?？拥拦な虏还苁窃诤推侥甏€是戰爭時期的戰略地位都極其重要，由于坑道處于密閉環境中，施工時設備運轉都會產生較大的噪聲，而且坑道對于噪聲吸收差，使其形成了持續性、來回反射的混合性噪聲，長期暴露于此環境中，可造成漸進性聽力損失。研究發現NIHL的發生存在個體易感性，遺傳因素可能使某些個體對噪聲的易感性更高[1]，目前NIHL易感的機制還不完全清楚，尚未見到有關血清分子標志物報道。

蛋白組學研究方法已經廣泛用于疾病特異性標記物的篩選工作，可以避免單個基因、多個基因簡單疊加產生的敏感度、特異度矛盾，對臨床診斷和疾病預后判斷具有重要的價值。本研究在前期研究[2]基礎上，通過雙向電泳及基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spetrometry，MALDI-TOF-MS)對坑道作業官兵NIHL易感個體和非易感個體血清差異表達蛋白進行分離和鑒定，為進一步研究坑道作業官兵NIHL易感性發生原因、篩選易感個體的血清分子標志物提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1材料與儀器 冷凍離心機(北京離心機廠)、IPGhor等電聚焦儀(美國GE Healthcare)、DALT-SIX SDS-PAGE電泳儀(美國GE Healthcare)、ImageScanner掃描儀(美國GE Healthcare)、ABI 5800 MALDI-TOF/TOF串聯質譜儀(德國Bruker公司)、真空冷凍干燥機(德國Christ公司)、血清高豐度蛋白去除試劑盒(美國Merck公司)、PDquest分析軟件(美國Bio-Rad公司)等。

1.2研究對象 前期研究[2]在某兩個施工坑道作業工齡1年以上的官兵中隨機抽取296名士兵，均為男性，年齡18～39歲,平均24.20±7.56歲，用Madsen ITERA(丹麥，爾聽美)聽力計按GB7583-1987檢測官兵脫離噪聲作業16～24小時后左、右耳0.125～8 kHz純音氣導聽閾，按照《工作場所物理因素測量噪聲》(GBZ/T 1 89.8—2007)規定的抽樣方法進行抽樣，使用個人聲暴露計(AWA一5610E型，杭州愛華儀器設備有限公司生產)測量坑道作業時不同工種的個體噪聲暴露強度和時間，并按等能量原理計算每個人的累積噪聲暴露量(cumulative noiseexposure,CNE)；根據上述結果,使用線性函數模型建立噪聲暴露與聽力損失之間的線性關系，分析自變量CNE(X)與因變量預測平均高頻聽閾(Y) (3 000、4 000、6 000 Hz三個頻率純音氣導聽閾均值)之間的關系；根據296名官兵實測的平均高頻聽閾與線性模型中的預測聽閾值繪制了人群易感分布圖，根據NIHL易感人群分布,將這296名士兵分為易感組和非易感組。本研究從上述易感組和非易感組中各選取20例作為研究對象，其中，易感組平均年齡24.79±2.03歲，高頻平均聽閾48.55±11.54 dB HL，語頻平均聽閾22.43±8.31 dB HL；非易感組平均年齡23.67±3.56歲，高頻平均聽閾9.40±2.54 dB HL，語頻平均聽閾13.40±4.13 dB HL，兩組年齡差異無統計學意義(P>0.05)。所有受試對象均簽署知情同意書，實驗方案經解放軍第309醫院醫學倫理委員會批準。

1.3血清樣品處理 每例研究對象抽取空腹靜脈血5毫升，進行雙向電泳研究。新鮮的血清樣品立即去除高豐度蛋白，轉移至超濾管中,4 000×g離心1 h進行除鹽濃縮，得到血清樣品,分裝,置- 80 ℃ 冰箱保存備用,用BCA 法測血清樣品濃度。

1.4雙向凝膠電泳 先進行第一向等電點聚焦，取-20 ℃冷凍保存的 IPG預制膠條(17 cm,pH4～7),室溫中放置10 min。沿著聚焦盤中槽的邊緣線性加入樣品,分清膠條的正負極,將IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中樣品溶液上,在每根膠條上覆蓋2 ～ 3 ml 礦物油,對好正、負極,蓋上蓋子,設置等電聚焦程序。然后進行第二項SDS-PAGE電泳，等點聚焦完畢,將IPG 膠條轉移至水化盤中,加入膠條平衡緩沖液Ⅰ (6 mol/L尿素,2% SDS,0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl,20%甘油,0.02 g/ml DTT),在水平搖床上緩慢搖晃15 min,吸掉平衡緩沖液I,再加入膠條平衡緩沖液II(6 mol/L 尿素,2% SDS,0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl,20% 甘油,0.025 g/ml碘乙酰胺),搖晃15 min；配置10%丙烯酰胺凝膠,電泳參數:40 V/gel 30 min,150 V/gel 4 h,直至溴酚藍線達膠底線。電泳結束后，銀染著色；凝膠圖像分析用掃描儀獲取圖片,用PDquest 8.0對2 組凝膠圖像分別進行背景消減,剪裁,匹配生成一致的凝膠圖像,2組間差異蛋白采用t檢驗進行分析,以變化倍數大于2.0倍或小于0.5倍且t檢驗滿足P<0.05為標準選擇差異蛋白點用于質譜分析[3]。

1.5蛋白質質譜鑒定 將需鑒定的差異蛋白點從膠圖上切下,經脫色、酶解等步驟后進行MALDI-TOF-MS 分析。將一級和二級質譜數據整合并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot 2.1(Matrix Science)對質譜數據進行分析和蛋白鑒定；搜索參數如下：數據庫為NCBInr；檢索物種為：human；酶為Trypsin；允許最大漏切位點為1；固定修飾為Carbamidomethyl(C)；可變修飾為Oxidation(M)和Acetyl (N-term)；MS tolerance 為100 ppm, MS/MS tolerance為：0.3Da.Protein score CI%大于95為鑒定成功。

1.6統計學方法 采用STATA 12.0統計軟件處理，符合正態分布的定量資料用均數±標準差描述，兩組間比較采用t檢驗。所有的統計檢驗均采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1血清蛋白雙向電泳圖譜分析結果 通過PDquest分析軟件對易感組和非易感組2-DE電泳圖譜進行自動檢測和匹配對分析，共檢獲蛋白斑點1 120個，經蛋白斑點的匹配和對比分析，可以發現兩組間蛋白表達圖譜明顯不同，主要表現為蛋白斑點灰度值的差異。易感組和非易感組差異表達(增高2倍或降低小于0.5倍且P<0.05)的蛋白斑點總數為37個(圖1),絕大多數集中于pH5～9 的偏酸性區域,相對分子量介于14.4～66.2 ku(圖2)。易感組這37個差異蛋白斑點灰度值均值為13 804.27±14 510.62，非易感組為79 820.32±139 333.2，易感組灰度值低于非易感組，差異有統計學意義(t=-2.758，P=0.009 1)。

圖1 坑道噪聲易感組與非易感組血清蛋白雙向電泳圖譜 a～c為易感組三次電泳結果,d～f為非易感組三次電泳結果

圖2 兩組坑道噪聲個體血清蛋白雙向電泳圖譜差異表達標注圖 a為易感組,b為非易感組

2.2差異蛋白斑點的質譜鑒定結果 對37個差異表達蛋白點進行質譜分析鑒定，獲得28個蛋白斑點的肽指紋圖譜(圖3)。采用Mascot軟件與NCBI數據庫中已知蛋白的標準肽指紋圖譜相比較,獲得各蛋白斑點的鑒定結果，其中易感組表達量比非易感組增加2倍以上的蛋白斑點22個，經質譜鑒定得到16個多肽；易感組比非易感組表達量減少0.5以上的蛋白斑點共15個，經質譜鑒定獲得12個多肽。排除高豐度蛋白，相同多肽選擇得匹配分值(mowse score)分大于66者，如：相同多肽匹配分值均大于66選擇得分高者，共獲得10個差異表達多肽(表1)，其中蛋白酶體亞基α-5、補體C4A、結合珠蛋白、載脂蛋白A-I和玻璃體結合蛋白在易感個體表達上調，而溶菌酶C、β-2糖蛋白- 1、色素上皮衍生因子、胰蛋白酶抑制劑重鏈H和甲狀腺素運載蛋白表達下調，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 差異蛋白斑點肽質量指紋圖譜 經4700型質譜儀鑒定,以其中含量最高的多肽(1437.6)峰值強度13019為100%

3 討論

為了從分子水平探討NIHL的預防方法，目前研究者主要是對基因與NIHL易感性的關系進行探討，其中單核苷酸檢測是篩選易感基因的主要方法[4]。由于研究對象的種族不同、研究方法不同、樣本量大小不同以及研究對象的職業不同、接觸的噪聲不同，不同的研究結果不完全一致，這也從一個方面反映了NIHL易感基因具有弱效性、異樣性或重疊效應，增加了易感基因研究的難度。

差異蛋白質組學研究重在找出有意義的差異蛋白，可以同時發現多個疾病特異性標記物，避免了用單一基因或數個基因的簡單疊加檢測產生的敏感度和特異性的矛盾，對疾病診斷標志物的篩選和診斷標準的制定具有重要意義。雙向電泳技術(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是蛋白質組學研究中分離蛋白質樣品的關鍵技術，能夠在一塊凝膠上分離出上萬個蛋白質且所得蛋白質組分純度>90%。在前期研究[2]基礎上，本研究利用2-DE加MODI-TOF-MS技術對我軍某部坑道作業官兵噪聲性聽力損失易感個體和非易感個體各20例血清進行雙向電泳研究，結果發現易感組差異表達蛋白質斑點灰度值較非易感組低(P<0.05)，進一步對差異表達的蛋白質斑點進行MALDL-TOF-MS和生物信息學分析鑒定,結合肽指紋圖譜在NCBI數據庫中準確匹配鑒定出差異表達的10種蛋白質，這10種蛋白中，蛋白酶體表達上調最明顯。蛋白酶體(proteasome)廣泛分布于真核細胞細胞質和細胞核中，與泛素一起構成主要降解細胞內蛋白的泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome path, UPP)；蛋白酶體是由1個20S核心蛋白酶體和2個19S調控組成，20S蛋白酶體由α環和β環組成圓筒狀結構，β環是蛋白酶體的活性位點，是水解反應發生的場所，而α環通過阻止蛋白進入水解空間控制底物與β環的接觸，從而調控β環的活性，因此α環對于蛋白酶體的功能發揮起重要作用。研究表明UPP存在于細胞代謝各個方面，此途徑調節異?；蚧钚韵陆蹬c許多疾病發生密切相關[5]。

表1 10個差異表達蛋白質電泳圖譜分析鑒定結果

注：數據庫源自NCBI BLAST，評分大于66為蛋白質匹配評價有顯著性意義(P<0.05)

蛋白酶體抑制劑可以抑制蛋白酶體活性，影響細胞的生長、分化和死亡過程，目前硼酸肽類蛋白酶抑制劑bortezomib已經應用于臨床腫瘤治療中，成為治療多發性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的強效化療藥物[6]。最近發現有些患者使用蛋白酶體抑制劑后出現了感音神經性聾，Lee等[7]對該副作用發生的原因進行了進一步的研究，發現bortezomib可以抑制PST1(perxisome signal transmission)信號途徑，導致自由基在細胞內大量聚集，最終可能與耳蝸毛細胞損傷和聽力下降有關，進一步證實了蛋白酶體參與氧化應激反應過程。UPP的一個重要生理功能就是參與細胞氧化應激過程的調節，有研究發現在過氧化氫處理后，視網膜色素上皮細胞系ARPE.19細胞內蛋白酶體的表達明顯增加，表達部位主要位于細胞核內和核膜周圍，這種細胞核內蛋白酶體的過表達可能對保護細胞核免受氧化應激的損傷有重要的作用[8]。以上研究說明UPP可以通過選擇性降解錯誤折疊或受損的蛋白質，應對不同環境的應激所引起的細胞內異常。

目前研究認為強噪聲引起的氧化應激是導致NIHL發生的主要原因，強噪聲可能引起大量自由基產生、誘導內質網應激性凋亡導致耳蝸組織損傷[9，10]。本研究結果顯示坑道噪聲易感個體與非易感者相比，血清中蛋白酶體α5亞單位表達顯著增加，提示其可能與NIHL的易感性有關，推測該蛋白可能通過以下途徑參與了NIHL的發生：①NIHL易感個體在坑道內長期慢性噪聲刺激作用下，可能更容易引起耳蝸內氧化應激反應，產生大量的過氧化氫等有害物質，細胞內代償機制引起蛋白酶體合成增加以應對環境的變化，保護細胞核等重要結構免受損傷；②在坑道噪聲的刺激下，蛋白酶體α5亞單位合成增加，使圓筒結構兩端封閉更加嚴密，導致泛素化底物無法與β環的催化酶接觸，激活內質網應激凋亡途徑導致細胞凋亡，或通過抑制過氧化物酶表達下降，使噪聲導致的氧化應激反應產生的自由基清除受阻，引起自由基堆積，通過損傷細胞DNA、使脂質過氧化等反應導致細胞凋亡或死亡。但這些推測還需要進一步的實驗證實。

此外，據報道，甲狀腺素運載蛋白(transthyretin，TTR)、補體C4A、β-2糖蛋白-1(β-2GPI)、人類色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)、胰蛋白酶抑制劑五種蛋白與耳聾相關。TTR基因突變是導致常染色體顯性遺傳性系統性淀粉樣變性的主要原因，提示TTR與耳蝸的結構和功能可能存在密切的關系[11]；本研究發現NIHL易感個體外周靜脈血中TTR蛋白表達比非易感個體明顯下調，說明該基因與坑道NIHL易感性發生可能存在一定相關性。C4A等補體片段又被稱為過敏毒素，可以引起很強的炎癥反應[12]，Harada[13]發現過敏毒素可導致豚鼠耳蝸血管紋囊性變、Reissner's膜塌陷、血管紋萎縮、迷路積水和耳蝸神經變性，說明過敏毒素可以導致耳蝸出現病理改變，這些改變與人類一些內耳疾病的病理變化相同，提示包括過敏毒素在內的炎性介質與內耳疾病發生密切相關；本研究結果顯示NIHL易感個體血清中補體C4A表達明顯升高，提示炎癥反應在坑道噪聲NIHL易感性發生中可能也起一定的作用。雙向電泳研究結果顯示梅尼埃病患者血清中β2-GPI表達下調，提示β-2GPI與其他蛋白有可能成為梅尼埃病早期診斷的分子標記物[14]；此外，研究者發現抗β-2GPI抗體可能與突發性聾患者的急性期狀況和預后有一定的相關性[15]；本研究結果顯示β-2GPI在坑道NIHL易感個體血清中表達降低，提示β2-GPI與坑道作業個體NIHL易感性可能相關。Ziff等[16]發現PEDF可能是耳硬化癥發病的共同致病基因，此外，PEDF在梅尼埃病患者血清中表達上調，提示PEDF與其他蛋白有可能成為梅尼埃病早期診斷的分子標記物[14]；從本研究結果看PEDF在坑道NIHL易感個體血清中表達降低，提示PEDF與坑道作業個體NIHL易感性可能相關。研究發現絲氨酸和金屬蛋白家族蛋白酶抑制劑在分泌性中耳炎的發生中起重要作用，α1抗胰蛋白酶制劑直接注射入南美洲栗鼠聽泡內對其內耳結構及功能均未造成明顯影響，提示胰蛋白酶抑制劑作為分泌性中耳炎治療藥物安全性較高[17]；本研究發現胰蛋白酶抑制劑在坑道NIHL易感個體血清中表達降低，其與坑道作業個體NIHL易感性也可能相關。

蛋白酶體[8]、結合珠蛋白[18]、TTR[11]、ApoA-I[19]、β-2糖蛋白-1[20]、PEDF[21]、胰蛋白酶抑制劑[22]和補體C4A[23]均與氧化應激的發生和發展有關，其中蛋白酶體、結合珠蛋白、ApoA-I表達上調可能是NIHL易感個體產生了應對較強的氧化應激反應措施、試圖維持內環境穩定的表現，補體C4在氧化應激時可能進一步被激活，產生大量的C4A加重了聽覺系統的損傷[23]，而TTR可能是在氧化應激產生的炎癥作用下出現表達下調，β-2糖蛋白-1和PEDF在NIHL易感個體中保護細胞免受氧化應激損傷的作用可能被過強的氧化應激反應削弱，從而導致這兩種蛋白表達下調，胰蛋白酶抑制劑抑制炎癥反應的作用也可能被NIHL易感個體中的氧化應激反應所損壞引起表達下調。因此，上述蛋白表達的增加或減少，可能通過不同程度加重NIHL易感個體氧化應激反應，使自由基生成增多，促進NIHL的發生，從而可能成為坑道作業官兵NIHL易感個體血清特異性候選分子標志物。

綜上所述，本研究結果為進一步研究坑道作業人員NIHL易感性發生原因提供了線索，也為探討血清篩選NIHL易感個體的方法提供了參考。本研究的結果還需要使用ELISA等方法在坑道施工作業者中進行進一步驗證。

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