菊粉外切酶的異源表達、純化及酶學性質

馬俊，安啟坤，唐文竹

(大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連，116034)

菊粉(inulin)是由D-果糖通過β-2,1-糖苷鍵連接而成的鏈狀多聚果糖，且末端以α-1,2-糖苷鍵連接有一個葡萄糖殘基[1]。菊粉作為一種儲備多糖，廣泛存在于植物的根和塊莖中,如菊芋(jerusalemartichoke)、菊苣(chicory)、大麗花(dahlia)和雪蓮果(yacon)等[2]。菊粉外切酶(exo-inulinase，EC 3.2.1.80)能從菊粉的非還原性末端的糖苷鍵開始逐一切下果糖基，因此可以用于水解菊粉生產高果糖漿(high fructose corn syrup， HFCS)[3-4]。高果糖漿具有低分子量、低熱量、高甜度、高滲透壓、高溶解度、沒有晶體形成等優勢，在酸奶、冰淇淋、巧克力牛奶等乳制品中被廣泛用作一種重要的甜味劑，同時在制藥企業也用于制作膠囊配方和注射液等[5]。目前，高果糖漿的制備主要有化學法、發酵法和酶法。其中，由于化學法和發酵法制備高果糖漿具有產率低，操作復雜，成本高，副產物多等缺點，酶法制備高果糖漿成為目前食品工業采用的主要方法[6]。但從野生菌中分離獲得的外切菊粉酶活性較低，且制備工藝復雜，因此成本居高不下，限制了該酶在高果糖漿生產中的應用。利用基因工程手段可以實現菊粉外切酶的高效表達，從而獲得高活性、高純度的菊粉外切酶，為菊粉外切酶水解菊粉生產高果糖漿奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

類芽孢桿菌(Paenibacillussp. Lfos16)、 pET28-a(+)載體、克隆宿主大腸桿菌DH10B、表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)均由本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

DNA膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒、DpnI、抗生素(卡那霉素)、IPTG、核酸染料(Goldview II)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性內切酶、PrimeSTAR DNA聚合酶等均購自Takara公司。Ni sepharose 6 Fast Flow親和純化填料購自GE公司。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH 7.0；LLB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 5，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菊粉外切酶基因的克隆及重組菌構建

采用Restriction Free Cloning[7-8]的方法，以Paenibacillussp. Lfos16的基因組DNA為模板，通過引物P1:5’-CCGCGCGGCAGCCATATGATGAACGGCGGCAT CG-3’ 和P2: 5’- GATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTACTTCAACCCTCCTTGATGTCT -3’ 對菊粉外切酶基因進行擴增，擴增產物經純化回收后再將其克隆至pET28-a(+)載體。

將2 μL上述克隆樣品加入到盛有100 μL新鮮制備的E.coliDH10B感受態細胞的管中，混勻內溶物，冰浴5 min。冰浴結束即刻將混合物轉移至冷的電擊杯內，輕擊液體以確?；旌衔镂挥陔姄舯撞?，擦干電擊杯外壁的冷凝水和霧氣，將電擊杯放進電擊儀，調節電擊轉化儀參數至2.5 kV、25 μF和200 Ω電擊轉化。電擊結束后迅速加入900 μL LB培養基，混勻，轉移所有液體混合物到無菌的2 mL離心管，37 ℃、200 r/min溫育1 h。將200 μL已轉化的感受態細胞涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養至長出適宜大小的單菌落。

挑取單菌落提取質粒，重組質粒通過XbaI、EcoRV雙酶切驗證及DNA測序，將驗證正確的質粒命名為pET28a-Exo-inu，并通過熱擊轉入E.coilBL21(DE3)，于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

1.2.2 重組菌的誘導表達及純化

接種菊粉外切酶重組表達菌至100 mL LLB(含30 μg/mL kanamycin)液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養至OD600=0.4～0.6，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，于16 ℃、180 r/min誘導18 h；離心收集菌體沉淀，并用ddH2O洗滌菌體2次，離心后用15 mL native binding buffer(pH 7.5)重懸菌體，并進行超聲破碎。10 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。

用native elution buffer(pH 6.5)平衡系統B相，native binding buffer(pH 6.5)平衡A相和Ni2+親和層析柱。加入3 mL粗酶液在室溫下與填料于充分結合1 h。用native binding buffer(pH 6.5)洗層析柱，收集洗脫峰處樣品，即為穿出液；調節B相比例15%，使咪唑終濃度為75 mmol/L，洗滌層析柱，收集洗脫峰處樣品，即為洗雜液。調節B相比例100%，使咪唑終濃度為500 mmol /L進行洗脫，收集洗脫峰處樣品，即為洗脫液；

分別取原酶液、穿出液、洗雜液、洗脫液進行SDS-PAGE檢測，確定純化效果。

1.2.3 重組菊粉外切酶轉化菊粉產物分析

450 μL 2%的菊粉溶液與50 μL純酶混合，于40 ℃下反應10 min，沸水浴5 min終止反應。10 000 r/min離心10 min，取上清液，采用TLC法[9]對產物組成進行確定。

1.2.4 酶活測定方法及定義

450 μL 2%的菊粉溶液或蔗糖溶液與50 μL純酶混合，以滅活的酶液與底物同比例混合做為對照，于40 ℃水浴反應10 min，沸水浴5 min終止反應，用DNS法測還原糖生成量。將以菊粉和蔗糖為底物時測定的酶活分別記為I和S。

酶活定義：上述反應條件下，每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活單位。

1.2.5 酶學性質測定

以下測定中底物均為2%的菊粉溶液。

①最適反應溫度：于不同溫度下測定酶活，根據相對酶活的大小確定最適反應溫度；②溫度穩定性：將純化后的酶液分別置于不同溫度下溫育2 h后，測定剩余酶活，根據相對酶活的大小確定溫度穩定性；③最適反應pH：將純化得到的酶液在不同pH緩沖液中測定酶活，根據相對酶活的大小確定最適反應pH；④pH穩定性：將純化后的酶液在不同pH緩沖液中，4 ℃靜置2 h后，測定剩余酶活，根據相對酶活的大小確定pH穩定性；⑤金屬離子對酶活的影響：向酶促反應體系中加入不同的金屬離子使其終濃度為 5 mmol /L，以未處理酶酶活力為對照，計算加入金屬離子后的相對酶活；⑥動力學常數測定：不同濃度的菊粉溶液與純化后的酶液等體積混合，于最適條件下反應10 min，測定還原糖的生成量。根據Lineweaver-Burk雙倒數法[10-11]計算出以菊粉為底物時重組外切菊粉酶的動力學常數Km和最大反應速度Vmax。

2 結果與分析

2.1 菊粉外切酶基因的擴增

以Lfos16的基因組為模板對菊粉外切酶編碼基因進行擴增，預期片段大小為2 305 bp。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢驗，其結果如圖1所示，產物大小與預期結果一致，且條帶單一。

1-exo-inulinase gene；M-DNA Marker圖1 菊粉外切酶基因擴增結果Fig.1 Amplification products ofexo-inulinase gene

2.2 pET28a-Exo-inu表達載體和工程菌的構建

挑取陽性克隆提取質粒，經XbaI、EcoRV雙酶切鑒定，預期得到大小分別為1 234 bp，1 957 bp和4 347 bp的3條片段。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產物進行檢驗，結果如圖2所示， 1為重組質粒的酶切鑒定結果，大小與預期結果一致，將鑒定正確的質粒進行測序，最終確定重組表達質粒pET28a-Exo-inu成功構建。將構建成功的重組表達質粒熱擊轉化至E.coilBL21(DE3)，于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

1-重組質粒；M-DNA Marker圖2 重組質粒酶切鑒定Fig.2 Detection of the recombinant plasmid pET28a-Exo-inu

2.3 重組菊粉外切酶的誘導表達和分離純化

按照1.2.2所述方法對重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu進行誘導表達，超聲破碎獲得粗酶液后，對重組菊粉外切酶進行純化，并收集各組分進行SDS-PAGE檢測，其結果如圖3所示。

M-Marker；1-粗酶液；2-穿刺液；3-洗雜液；4-洗脫液圖3 重組菊粉外切酶的親和純化SDS-PAGE結果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinantexo-inulinase after affinity purification

帶有組氨酸標簽的重組菊粉外切酶與Ni2+特異性結合，而不能與Ni2+結合的蛋白及結合能力弱的雜蛋白洗脫流出，最終獲得的單一條帶為電泳純的重組酶。SDS-PAGE檢測表明重組菊粉外切酶表觀分子量約為87 kDa，與理論大小一致。

以菊糖為底物，重組菊粉外切酶的純化結果如表1所示。經過Ni2+親和純化，純化倍數達到3.98倍，回收率為2.80%，比酶活為348.30 U/mg，相比文獻已報道的菊粉外切酶的比酶活高。RAM等[12]從PenicilliumoxalicumBGPUP-4分離純化得到兩種菊粉外切酶，以菊粉為底物的比酶活分別為113.19 U/mg和120.47 U/mg。

表1 重組菊粉外切酶分離純化結果Table 2 Summary of recombinantexo-inulinase purification

2.4 重組菊粉外切酶轉化菊粉產物分析

重組菊粉外切酶與2%菊粉反應產物TLC結果如圖4所示。

1-菊粉；2-菊粉外切酶水解菊粉產物；3-葡萄糖；4-果糖圖4 重組菊粉外切酶菊粉水解產物的TLC分析Fig.4 TLC analysis of products from inulin by recombinant exo-inulinase

可以看出反應10 min后底物被完全降解，產生產物果糖(F)及少量葡萄糖(G)，底物轉化率為100%。

2.5 重組菊粉外切酶酶活測定

以2%菊粉和2%蔗糖分別為底物測定酶活力，結果顯示，以菊粉為底物的酶活(I)為259.37 U/mL，以蔗糖為底物的酶活(S)為592.16 U/mL。粗酶液的I/S為0.438，I/S<1，表明該酶為菊粉外切酶[13-14]。

2.6 重組菊粉外切酶酶學性質測定

2.6.1 重組菊粉外切酶的最適溫度與溫度穩定性

溫度對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖5所示。

圖5 溫度對重組外切菊粉酶酶活的影響Fig.5 Effects of temperature on activity of recombinant exo-inulinase

重組菊粉外切酶的最適作用溫度為40 ℃；當溫度低于40 ℃時，酶活隨溫度的升高而升高；當溫度高于40 ℃時，酶活隨溫度的升高而降低，當溫度在25～35 ℃時，具有80%以上的相對酶活。

溫度對重組菊粉外切酶穩定性的影響如圖6所示。重組菊粉外切酶在溫度低于30 ℃時具有較高的穩定性，在低于30 ℃保溫2 h剩余酶活仍高于90%；當溫度高于30 ℃時，剩余酶活很快降低，當溫度達到35 ℃時，剩余酶活降至15%以下。

圖6 溫度對重組外切菊粉酶穩定性的影響Fig.6 Effects of temperature on stability of recombinant exo-inulinase

本研究中重組菊粉外切酶與文獻報道的來源于Paenibacillussp. d9 菌株的菊粉外切酶性質比較接近，最適作用溫度均為40 ℃[15]。而與其他菊粉外切酶相比差別較大，來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶最適溫度是55 ℃，且在35～55 ℃靜置24 h后仍剩余80%以上的酶活[16]。來源于Aspergillusniger的菊粉外切酶最適溫度為60 ℃，在低于60 ℃保溫1 h依然有85%酶活性[17]。因此本研究中的重組菊粉外切酶屬于低溫酶，不但在低溫條件下可以高效反應，而且在生產工藝中可以通過較低溫度的熱處理使酶失活，節約能源和費用，這就使得低溫菊粉外切酶在菊粉來源高果糖漿的生產中具有良好的應用前景。

2.6.2 重組菊粉外切酶的最適pH與pH穩定性

pH對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖7所示。重組菊粉外切酶的最適作用pH為6；當pH低于6時，酶活隨pH的升高而升高；當pH高于6時，酶活隨pH的升高而升降低，且當pH達到7時，相對酶活降至40%以下。

圖7 pH對重組菊粉外切酶酶活的影響Fig.7 Effects of pH on activity of recombinant exo-inulinase

不同pH下重組菊粉外切酶的穩定性如圖8所示。當pH處于6.6～7.6時，重組菊粉外切酶具有較高的穩定性，剩余酶活高于90%；當pH低于6或高于8時，剩余酶活力降至40%以下。

重組菊粉外切酶的最適作用pH與pH穩定性與文獻報道基本一致。如李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的菊粉外切酶于PichiapastorisGS115中進行表達，重組菊粉外切酶的最適pH為4.62。KOBAYASHI等[19]將來源于Microbulbifersp. Strain JAM-3301的菊粉外切酶基因通過大腸桿菌進行表達，其最適pH為6.0，在pH 8～9相對穩定。CHEN等[20]將AspergillusficuumJNSP5-06中的菊粉外切酶在大腸桿菌中進行過表達，其最適pH為4.0，并在pH為3.0～4.5時菊粉外切酶穩定性較好。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達，其最適pH為4.5，在4 ℃，pH 3.0～6.0環境中溫育24 h時，能剩余90%酶活。

2.7 金屬離子對菊粉外切酶活性的影響

金屬離子對重組菊粉外切酶的影響如表2所示。其中，Li+對重組菊粉外切酶有一定的激活作用；其余金屬離子均有不同程度的抑制作用，其中Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+對重組菊粉外切酶具有顯著抑制作用，剩余酶活降至10%以下。

各種金屬離子對不同來源的菊粉外切酶的影響差異較大。其中Cu2+能夠完全抑制來源于AspergillusficuumJNSP5-06的菊粉外切酶酶活[20]，而對來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶酶活具有激活作用[21]；Fe2+、Zn2+及Mg2+對來源于PaenibacilluspolymyxaZJ-9的外切型菊粉酶的酶活具有輕微激活作用[22]。

2.8 重外菊粉外切酶動力學常數測定

采用Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，以1/[S]為橫坐標，1/V為縱坐標，測得Km和Vmax的值，結果如圖9所示。得到的回歸方程為y=108.14x+5.608 1，R2=0.998 8。通過分析計算出以菊粉為底物時Km為19.28 mg/mL，Vmax為0.18 mg/(min·mL)。

圖9 重組菊粉外切酶的Lineweave-Burk雙倒數曲線Fig.9 Lineweave-Burk double reciprocal curve of recombinant exo-inulinase

來源不同的菊粉外切酶動力學常數差別較大，可能是由于酶活測定方法、底物組成以及計算方法等的差異引起的。其中CHEN等[20]在大腸桿菌中表達AspergillusficuumJNSP5-06中克隆出菊粉外切酶，以菊粉為底物的Km和Vmax分別為(7.1±0.2) mmol/L和(1 000.0±0.1) μmol/(min·mg)。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達，Km為0.322 mmol/L，Vmax為4 317 μmol/(min·mg)。李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的外切菊粉酶于PichiapastorisGS115中進行表達，以菊粉為底物時，Km和Vmax分別為80.53 g/L和4.49 g/(L·min)。

3 結論

通過RF克隆成功將來源于類芽孢桿菌Paenibacillussp. Lfos16的菊粉外切酶基因重組到pET-28a(+)表達載體上，并在E.coliBL21(DE3)實現了高效表達。通過鎳柱親和層析獲得了電泳純的重組菊粉外切酶。重組菊粉外切酶的表觀分子質量為87 kDa，水解菊糖的產物為果糖，且I/S為0.438，確定為外切酶活性。以菊粉為底物，重組菊粉外切酶的比酶活為348.30 U/mg，最適作用溫度和pH分別為40 ℃和pH 6，且當溫度低于30 ℃，pH在6.6～7.6時時酶活較穩定；Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+具有顯著抑制作用；重組菊粉外切酶對菊粉的Km為19.28 mg/mL，Vmax為0.18 mg/(min·mL)。