核桃葉片愈傷組織的誘導及植株再生研究

戴小云 武春霞

摘? 要：以雜種核桃組培苗的葉片和葉柄為材料，設置5種激素組合進行葉片和葉柄愈傷組織的誘導，并設置4種激素組合進行愈傷組織再分化的誘導，以研究雜種核桃的組培再生技術。結果表明：葉柄較葉片更容易發生愈傷組織，并且褐化率較低;TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1 2種植物激素組合最適合愈傷組織的誘導。產生的愈傷組織呈白色和黃白色，為非胚性愈傷組織。在4種激素組合下愈傷組織器官，但均未誘導成功。部分愈傷組織有增殖，培養1個月后全部褐化。研究說明雜種核桃的愈傷組織較容易誘導發生，而器官的再分化較困難。

關鍵詞：核桃;愈傷組織;植物激素;植株再生

中圖分類號 S662文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）13-0044-04

Abstract：In order to study the tissue culture regeneration technology of hybrid walnut，in this study we used the leaves and petioles of hybrid walnut tissue culture seedlings as materials，and 5 hormone combinations were set to induce callus of leaves and petioles. In addition，4 hormone combinations were set to induce callus redifferentiation. The results showed that the petioles was more easy to induce callus than leaves，and the browning rate was lower. We found two hormone combinations which TDZ4mg·L-1+2，4-D1.5mg·L-1 and 6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1 were the most suitable for callus induction. The callus induced was white and yellowish white，but it was non-embryonic callus. Organ induction from callus was all not successful under the combinations of 4 hormones. Some of the callus proliferated and all browned after cultured one month. It showed that callus of hybrid walnut was easy to induce，but the redifferentiation of organs was difficult. The results of this study laid a certain foundation for further study on walnut callus organ differentiation.

Key words：Walnut;Callus;Phytohormone;Plant Regeneration

1 前言

核桃（Juglan regia L.）屬胡桃科核桃屬的落葉高大喬木，因其核仁營養豐富，風味獨特和用途多樣而躋身于世界四大干果之一。核桃具有較高的經濟價值，除核仁可食用外，其全株各個部分都各有用途[1-3]，因而成為農民脫貧致富的主要經濟樹種，也是我國糧油的戰略儲備樹種，具有良好的發展前景。

植物組織培養是重要的生物技術之一，在植物的快速繁殖、資源的離體保護等方面已廣泛應用。植物組織培養在植物生物技術中占據著核心位置，通過植物組織培養還可以實現植株的再生。目前已在多種植物上獲得成功，如柚木、棗樹、藍莓等[4-6]，為植物基因工程遺傳轉化及優良無性系的快速繁殖研究奠定了基礎。自上世紀60年代末，世界各地開始了核桃組織培養技術的研究。1969年，美國的Cummins等首次誘導黑核桃（Juglans nigra）莖段獲得了愈傷組織，然而并未得到分化的器官。1981年，Chalupa以改良的MS為基本培養基，首次報道了以核桃實生苗莖段作為外植體的完整植株形成過程[7]。我國關于核桃組織培養的相關研究開始較晚，直到1986年，袁巧平等以核桃腋芽作為外植體，重點研究了植物激素條件對誘導核桃形成完整植株的影響[8]。湯浩茹等在2000年采用核桃的幼胚胚軸和子葉作為外植體，成功的誘導出了體細胞胚和完整的植株[9]。然而，該技術難度較大，取材時期要求較嚴格、污染較高、外植體易褐化，并且較難分化、容易發生退化現象、增殖速率不高、生根困難，這一系列的問題一直都沒能得到很好的解決。核桃組培苗無菌，葉片數量較大，容易獲得，因此是良好的外植體材料。關于葉片愈傷組織的誘導，目前已有報道，李好先、張燕等分別以綠波核桃和汾陽核桃葉片為試材，進行了愈傷組織的誘導[10，11]。然而，關于核桃葉片誘導植株再生的研究，目前還比較少，并且比較困難。

在植物組織培養中，植物激素是重要的調節劑。生長素和細胞分裂素尤為重要，在愈傷組織的誘導和器官的分化中起著重要的調節作用。不同激素種類及濃度的組合所產生的作用效果截然不同。一般當生長素濃度相對細胞分裂素濃度高時有利于組培苗根的分化，反之則利于不定芽的形成。Heile-Sudholt等在以黑核桃的胚軸和實生苗莖尖為外植體的誘導研究中發現胚根、上胚軸、不定芽及愈傷組織誘導在很大程度上受到6-BA濃度的影響，且6-BA能刺激愈傷組織的形成[12]。TDZ是活性較高的細胞分裂素類物質，李好先等采用綠波核桃葉片作為外植體，研究結果表明較低濃度的TDZ（2.0～4.0mg·L-1）對葉片愈傷組織的形成具有促進作用;高濃度（8.0～10.0mg·L-1）則作用相反，同時對葉片和愈傷組織的褐化有抑制作用，使形成的愈傷組織比較疏松。生長素在愈傷組織的形成中也具有重要的作用，研究發現低濃度的IBA（0.01～0.5mg·L-1）對葉片愈傷組織的形成是有利的，高濃度的IBA（>1.0mg·L-1）則抑制愈傷組織的形成[13]。由此可見，同種植物激素的不同類型在組織培養中的作用和對于不同的材料植物激素所起的作用都存在一定的差異。

本研究以雜種核桃為試材，該種核桃生長旺盛，可以作為良好的砧木，研究其無性化繁殖對核桃的良種化和一致性具有重要的意義。因此，我們以該種核桃葉片為外植體，利用不同組合的生長素和細胞分裂素，篩選適宜核桃愈傷組織誘導及器官分化的最佳組合，為核桃的遺傳轉化研究及無性系的快速繁殖奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 試驗材料 試驗以天津農學院東校區雜種核桃樹為試驗材料。

2.2 試驗方法

2.2.1 無菌體系的建立 選擇在晴天采集健康無損傷的核桃嫩枝帶回實驗室。去掉葉柄，留下1段小葉柄。用軟刷蘸取洗潔精刷洗嫩枝，并置于流水沖洗2～3h。之后用0.3%的過氧乙酸進行消毒處理，處理2次，每次5min，然后用無菌水漂洗3～4次。分割成1芽1段接種于培養基中進行培養。

2.2.2 葉片和葉柄愈傷組織的誘導 取無菌苗中上部葉片為試材，將葉片切分成1cm×1cm的小塊，接種于愈傷組織誘導培養基上，以MS為基礎培養基，設置5種激素配比，分別為6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理1），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理2），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1（處理3），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（處理4），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（處理5）。

2.2.3 愈傷組織器官分化誘導 將誘導產生的愈傷組織切分成1cm×1cm的小塊，接種于器官分化誘導培養基上，以MS為基礎培養基，設置4種激素配比6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理6），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理7），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（處理8），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（處理9）。

3 結果與分析

3.1 不同激素組合對葉片愈傷組織形成的影響 從表1中可以看出，處理1和處理3愈傷組織發生量最多，并且處理3的葉片褐化數最少;處理5的效果最差，愈傷組織發生量最少，只有3個愈傷組織形成且較小。由于接種后置于黑暗條件培養，產生的愈傷組織主要呈黃白色或白色。

從圖1中可以看出，愈傷組織發生率由高到低依次為處理1>處理3>處理4>處理2>處理5，處理1、處理3和處理4之間差異不明顯，處理5與其他處理之間有明顯的差異，并且其褐化也較明顯。綜合比較處理3最適合核桃葉片愈傷組織的誘導。

3.2 不同部位對愈傷組織發生的影響 本試驗分別以葉片和葉柄為材料進行了愈傷組織的誘導。從表2中可以看出，整體上各個處理下葉柄愈傷組織的發生量大于葉片愈傷組織的發生量，尤其在處理3和處理4誘導下葉柄的愈傷組織發生量最大，并且在處理4下葉柄愈傷組織的發生率達到100%。

由圖2可見，葉柄總的愈傷組織發生率明顯高于葉片愈傷組織的發生，愈傷組織平均出愈率為67%;而褐化率剛好相反，葉柄的褐化率明顯低于葉片的褐化率，葉柄平均褐化率為17%。說明葉柄比葉片更容易產生愈傷組織，并且不易發生褐化。

3.3 不同激素組合對愈傷組織器官分化的影響 本試驗分別以葉片和葉柄產生的愈傷組織，在4種激素組合下進行了再分化的誘導。于誘導后的15d和30d分別進行觀察。從表3中可以看出，誘導后的15d處理6和處理8仍有部分未褐化，處理7和處理9已全部褐化。處理8愈傷組織有明顯的增殖，顏色轉為綠色。其他處理的愈傷組織也有不同程度的變綠現象，處理6中愈傷組織表面出現白色粉狀物，沒有發現器官的分化。到誘導的30d時，所有處理的愈傷組織全部發生褐化，并且褐化明顯加重。處理6和處理8的愈傷組織有明顯的增殖，褐色部分增多，在愈傷組織的中部仍呈綠色。處理9的褐化程度最重，顏色呈黑褐色，仍未見器官的分化。

從表4可以看出，在誘導后的15d，處理7、處理8和處理9都有部分未褐化，尤其處理8和處理9未褐化數量較多，處理8愈傷組織呈綠白色，處理9愈傷組織呈黃白色至淺綠色。處理7愈傷組織大部分褐化，并且愈傷組織上部出現水浸狀。各處理均為出現器官的分化。誘導后30d時，只有處理8為全部發生褐化，愈傷組織中部呈綠色，較松散。處理6的愈傷組織沒有明顯增殖，全部褐化呈黑色。處理9的愈傷組織仍有大部分呈綠色，但上部發生褐化較嚴重。所有的處理都沒有產生器官的分化。

4 結論

以葉片和葉柄作為材料誘導愈傷組織，葉柄比葉片更容易產生愈傷組織。綜合愈傷組織發生率及褐化率，在植物激素TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1的條件下，最利于葉片愈傷組織的形成。在植物激素TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1的條件下，最利于葉柄愈傷組織的形成。在這5種激素組合誘導下形成的愈傷組織都是非胚性愈傷組織。在6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理6），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理7），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（處理8），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（處理9）4種激素處理下，葉片及葉柄產生的愈傷組織均未發生器官的分化。

參考文獻

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（責編：楊 林）