羊乳活性發酵飲品中益生元增菌特性及發酵工藝優化

文/王海燕 姚 路 高 鵬 梁秀珍 崔秀秀 葛武鵬＊

（1 西北農林科技大學食品科學與工程學院；2 陜西飛天乳業有限公司；3 陜西百躍羊乳集團有限公司）

益生元，又稱益生素，在人體內不會被腸道消化吸收，能夠選擇性刺激腸內有益菌群生長增殖，提高菌體活性[1～3]。益生元除常見的菊粉（Inuline）、低聚異麥芽糖（IMO）、低聚果糖（FOS）等功能性糖類外，還包括蛋白質水解物、天然植物及中草藥提取物等[4]。目前，菊粉[5，6]、低聚果糖[7]、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖（GOS）等功能性低聚糖被廣泛應用于保健食品和飼料中[8～11]，已替代或部分替代蔗糖應用到乳制品中[12～14]。

活性益生菌發酵飲品以獨特的風味、色澤及多重營養保健功效，深受消費者青睞。目前，市場主流活性益生菌發酵飲品多以牛乳為基料，尚未出現羊乳發酵飲品[15]。而現如今羊乳及其制品的營養特性已被越來越多的消費者接受，漸成流行之勢，消費者對羊乳制品種類的需求層次不斷提高[16，17]。本試驗以副干酪乳桿菌為發酵劑，以活菌數為指標，繪制其在羊乳中的生長曲線，并對低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖四種益生元進行篩選和復配，得到增菌效果較好的益生元；同時對活性益生菌羊乳發酵飲品的發酵工藝進行優化，為活性益生菌羊乳發酵飲品的開發提供理論支撐，以促進羊乳制品種類多樣化發展，滿足消費者需求。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 材料

西北農林科技大學西農薩能乳山羊畜牧基地生產的羊乳；新西蘭恒天然（中國）有限公司生產的脫脂乳粉；陜西百躍優利士乳業有限公司提供的低聚果糖（純度≥95%）、菊粉（純度≥90%）、低聚半乳糖（純度≥55%）、低聚異麥芽糖（純度≥50%）；發酵劑為臺灣生合生物科技有限公司生產的副干酪乳桿菌。

1．1．2 試劑

MRS培養基；其余試劑均為分析純。

1．2 儀器與設備

立式蒸汽滅菌器、高速離心機、凈化工作臺、電熱恒溫培養箱、電子天平、電熱恒溫水浴鍋、冰箱、發散乳化機、恒溫振蕩器、微量移液器、干燥箱。

表1 正交試驗因素水平表

1．3 方法

1．3．1 發酵劑的制備

制備滅菌脫脂乳培養基（12%脫脂乳粉，加入0.50‰葡萄糖，115 ℃、20 min高溫高壓滅菌），冷卻至40 ℃，在無菌條件下接種副干酪乳桿菌，在37 ℃恒溫培養箱中培養至凝乳。經2～3 次活化使其活力充分恢復后，即可作為酸奶發酵劑。

1．3．2 副干酪乳桿菌生長曲線的測定

取制備好的副干酪乳桿菌以4%的接種量接種于殺菌脫脂羊乳（1 500 ×g、30 min離心脫脂）中，37 ℃培養77 h，每隔7 h取樣測定活菌數，繪制生長曲線?；罹鷶禍y定參考GB4789.35—2016[18]，利用無菌生理鹽水對發酵羊乳進行梯度稀釋，通過預試驗確定合適的稀釋梯度，取1.00 mL稀釋樣品于選擇性培養基以平板涂布法計數樣品中活菌數，統計菌落數，結果取其平均值，單位為CFU/mL。

1．3．3 滴定酸度測定

根據GB5009.239—2016酸度測定方法[19]，用0.10 mol/L的NaOH標準溶液滴定測定，單位以吉爾涅爾度（°T）表示。

1．3．4 益生元的增菌特性

脫脂羊乳中分別添加低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖四種益生元，添加的濃度依次為0.00%、0.70%、1.40%、2.10%、2.80%（m/v），殺菌后冷卻至37 ℃，接種副干酪乳桿菌，37 ℃恒溫發酵，在39 h、42 h、47 h時，測定活菌數，篩選增菌效果較好的益生元。

1．3．5 益生元復配

復配菊粉和低聚果糖，總添加量為1.40%，菊粉與低聚果糖的比例為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，以二者復配組為實驗組，以單獨添加菊粉、低聚果糖組及不添加益生元組為空白對照組。37 ℃恒溫發酵，在39 h、42 h、47 h時，測定活菌數，確定最佳復配比例。

1．3．6 接種量確定

向已殺菌冷卻至37 ℃的脫脂羊乳中分別接入2%、3%、4%、5%、6%（v/v）副干酪乳桿菌，37℃培養42 h，測定活菌數和滴定酸度，確定最佳接種量。

1．3．7 最優發酵條件確定

以益生元添加量、接種量及發酵時間為因素，以活菌數和滴定酸度為評價綜合指標，采用L9（34）正交表，進行三因素三水平正交試驗，利用排隊評分法和公式評分法相結合的綜合評分法對試驗結果進行分析，確定活性益生菌羊乳發酵飲品最優發酵工藝條件。正交試驗各因素水平見表1。

1．4 數據處理

采用Excel和SPSS進行統計分析，采用排隊評分法和公式評分法相結合的綜合評分法對結果進行雙指標分析，顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果與討論

2．1 副干酪乳桿菌在羊乳中的生長曲線

由圖1可知，副干酪乳桿菌在脫脂羊乳中的生長曲線呈“S”型，菌體延滯期比較短，很快進入對數生長期，活菌數迅速增加。當發酵至21 h時，菌體開始進入穩定期。此菌的穩定期長，為21～42 h，這一時間段，活菌數基本維持不變，42 h活菌數達到最大值，為1.87×109CFU/mL。42 h后，活菌數開始下降，逐漸進入衰退期，乳酸積累過多，抑制菌體生長，發酵至77 h時，活菌數為1.23×109CFU/mL。

2．2 菊粉在羊乳中的增菌性能分析

試驗探究菊粉增菌特性，以添加菊粉組為實驗組，以不添加菊粉組為空白對照組，結果如圖2。隨著菊粉添加量的增加，活菌數先增加后減少，活菌數對菊粉有一定濃度依賴性。菊粉添加量對菌體生長有顯著性影響（P＜0.05）。當菊粉添加量為1.40%時，活菌數最高，39 h、42 h、47 h分別達到2.21×109CFU/mL、2.47×109CFU/mL和2.31×109CFU/mL，空白對照組分別為1.84×109CFU/mL、1.95×109CFU/mL和1.85×109CFU/mL，實驗組活菌數明顯高于空白對照組；且39～42 h時間內，活菌數增長率比空白對照組高5.79%。結果表明，菊粉有較好的增菌作用，且最適添加量為1.40%。菊粉可以被乳酸菌發酵，具有雙歧桿菌增值因子的作用[20]，菊粉可以作為益生元調節腸道益生菌，同時還具有降血脂、降膽固醇、減肥和保護肝臟、預防癌癥和促進維生素及礦物質吸收等多種生理功能[21]。

圖1 副干酪乳桿菌在羊乳中生長曲線

圖2 菊粉添加量對發酵羊乳中活菌數的影響

圖3 低聚果糖添加量對發酵羊乳中活菌數的影響

2．3 低聚果糖在羊乳中的增菌性能分析

本試驗探究低聚果糖增菌特性，以添加低聚果糖組為實驗組，以不添加低聚果糖組為空白對照組，結果如圖3。低聚果糖添加量為0.70%～2.10%時，實驗組活菌數均高于空白對照組，當添加量為2.80%時，實驗組活菌數低于空白對照組，可能是因為低聚果糖添加量過大，造成滲透壓偏高，導致菌體生長受到抑制。經方差分析可知，不同低聚果糖的添加量對菌體生長有顯著影響（P＜0.05）。當低聚果糖添加量1.40%時，發酵羊乳中活菌數最高，在39 h、42 h、47 h時，分別達到3.09×109CFU/mL、3.37×109CFU/mL和3.15×109CFU/mL，空白對照組分別為2.80×109CFU/mL、2.91×109CFU/mL和2.53×109CFU/mL；39～42 h時間內，菌體增長率比空白對照組高5.13%，說明低聚果糖有較好的增菌作用。

低聚果糖添加量為1.40%時，在42～47 h內，空白對照組活菌數減少10.69%，實驗組僅減少7.10%，表明低聚果糖一定程度上有利于延緩菌體的衰亡。試驗結果表明，低聚果糖有較好的增菌作用，且最適添加量為1.40%，并一定程度上有利于延緩菌體衰亡。在發酵羊乳中添加低聚果糖，可以延長產品貨架期，增強乳制品良好的口感風味，增加水溶性可吸收鈣的含量，使乳制品更易消化吸收，提高發酵乳產品的功效[22]。

2．4 低聚半乳糖在羊乳中的增菌性能分析

試驗探究低聚半乳糖增菌特性，以添加低聚半乳糖組為實驗組，以不添加低聚半乳糖組為空白對照組，結果如圖4。低聚半乳糖添加量為0.70%～2.10%時，實驗組活菌數與空白對照組相比略有增加，添加量為2.80%時，實驗組活菌數低于空白對照組，可能是由于添加量過多，不利于菌體生長。經方差分析可知，低聚半乳糖對菌體的生長無顯著影響（P＞0.05）。

當低聚半乳糖添加量2.10%時，發酵羊乳中活菌數較高，在39 h、42 h、47 h時，分別達到2.29×109CFU/mL、2.55×109CFU/mL和2.50×109CFU/mL，空白對照組分別為2.17×109CFU/mL、2.40×109CFU/mL和2.32×109CFU/mL，39～42 h時間內，活菌數增長率比空白對照組高0.76%。結果表明，低聚半乳糖有一定增菌作用，且最適添加量為2.10%，但促進作用不如菊粉和低聚果糖明顯。

圖4 低聚半乳糖添加量對發酵羊乳中活菌數的影響

圖5 低聚異麥芽糖添加量對發酵羊乳中活菌數的影響

2．5 低聚異麥芽糖在羊乳中的增菌性能分析

試驗探究低聚異麥芽糖增菌特性，以添加低聚異麥芽糖組為實驗組，以不添加低聚異麥芽糖組為空白對照組，結果如圖5。實驗組中低聚異麥芽糖添加量為1.40%時，實驗組活菌數略高于空白對照組，在39 h、42 h、47 h時，分別為2.31×109CFU/mL、2.70×109CFU/mL和2.33×109CFU/mL，對照組分別為2.30×109CFU/mL、2.69×109CFU/mL和2.16×109CFU/mL；39～42 h時間內，活菌數增長率與空白對照組基本一致。當添加量為2.80%時，實驗組活菌數低于空白對照組，可能是因為添加量過大，造成滲透壓偏高，不利于菌體生長。方差分析可知，低聚異麥芽糖的添加量對活菌數有顯著影響（P＜0.05），但增菌效果不如菊粉和低聚果糖明顯。

2．6 低聚糖復配

由以上試驗結果發現，菊粉與低聚果糖能較好的促進發酵羊乳中菌體增殖，故選擇菊粉與低聚果糖進行復配，觀察二者共同作用的增菌效果是否優于單獨使用。

由圖6可以看出，單獨添加菊粉、低聚果糖或者二者復配添加后，活菌數均高于不添加任何益生元的空白對照組，且復配比例對活菌數有顯著影響（P＜0.05）。菊粉與低聚果糖的比例為9:1時，在42 h活性益生菌羊乳發酵飲料中的活菌數達到最大值，為2.86×109CFU/mL。

2．7 接種量對菌體生長的影響

由圖7可知，隨著接種量的增加，活菌數不斷增加，滴定酸度不斷增大，這是因為接種量越多，乳酸菌在乳中定植生長越快，產酸速度也越快，接種量由2%增加至4%時，活菌數迅速增加，超過4%后，活菌數增加趨勢減小，經方差分析可知，接種量對發酵羊乳中副干酪乳桿菌菌體數量和滴定酸度有顯著影響（P＜0.05）。接種量超過5%時，發酵乳中乳清析出現象隨著接種量的增加而加劇，綜合考慮，試驗選擇3%、4%、5%三個水平進行正交設計，確定最佳接種量。

圖6 菊粉/低聚果糖復配對發酵羊乳中活菌數的影響

圖7 接種量對發酵羊乳中活菌數和滴定酸度的影響

2．8 最佳發酵條件確定

以接種量、發酵時間及益生元為單因素，以活菌數和滴定酸度為評價綜合指標，試驗采用L9（34）正交表，進行三因素三水平的正交設計，確定最佳發酵工藝條件，結果如下。

由表2和表3可知，益生元添加量（A）、接種量（B）、發酵時間（C）三個因素對試驗綜合評分影響的主次順序為益生元添加量＞發酵時間＞接種量，即益生元添加量對綜合評分有極顯著影響（P＜0.01），為決定性因素；其次為發酵時間和接種量，二者對綜合評分有顯著性影響（P＜0.05），其中接種量的影響最小?；钚砸嫔蛉榘l酵飲料的最佳發酵條件是A2B2C1，即益生元添加量為1.50%，接種量為4%，發酵時間為40 h。

表2 正交試驗結果與分析

2．9 正交試驗驗證

對正交試驗分析得到的最優發酵組合A2B2C1，進行多次重復性（n=3）驗證試驗，結果表明，發酵羊乳中活菌數達到1.91×109CFU/mL、滴定酸度為138.90 °T（P＞0.05），且凝乳均勻細膩，香味濃郁，故活性益生菌羊乳發酵飲料的最佳發酵工藝優化條件是A2B2C1，即益生元添加量為1.50%，接種量為4%，發酵時間為40 h。

表3 方差分析

3 小結

3．1 發酵劑副干酪乳桿菌在羊乳中發酵42 h時，活菌數達到最大值，為1.87×109CFU/mL。

3．2 以活菌數為指標，研究低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖四種益生元的增菌特性，結果表明，四種益生元均能促進乳酸菌的體外生長增殖，增殖效果較好的是菊粉和低聚果糖，且最適添加量均為1.40%。

3．3 在菊粉和低聚果糖混合制的復合益生元研究中，發現菊粉與低聚果糖復配比例為9:1時，對增菌作用較為明顯，且優于單獨使用。

3．4 發酵工藝優化發現，以益生元添加量、接種量、發酵時間為因素，經正交優化和驗證試驗確定活性益生菌羊乳發酵飲品的最優發酵工藝參數是：益生元添加量為1.50%，接種量為4%，發酵時間為40 h，此條件下，發酵羊乳中活菌數達到1.91×109CFU/mL。