菊粉和低聚果糖對發酵乳品質的影響

何 君 韓育梅 劉 敏 李 艷 鄔 婷 鄭 巖 王雅楠

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院 呼和浩特010018）

益生元是一類經人體口腔、胃和小腸消化后在結腸內調節腸道菌群產生有益作用的食品組分，菊粉和低聚果糖屬于菊粉型果聚糖，是常見的益生元[1]。菊粉和低聚果糖既可由菊苣類植物提取也可人工制備，菊粉水解后產生低聚果糖，二者結構相似，均由葡萄糖單元和果糖單元間通過β-葡萄糖苷鍵相連，菊粉聚合度為10 到60，低聚果糖聚合度為2 到9[1]。它們的理化性質及應用效果不同，低聚果糖易溶于水，易被微生物利用分解，有甜味；而菊粉難溶于水，難被微生物利用分解，且穩定性和黏度較好，還可作為添加劑增強食品的結構[2]。發酵乳是以牛乳或乳粉為原料，發酵后制成的pH 值降低的產品[3]。一定數量的益生菌對于宿主健康起到作用，單獨發酵或者與普通發酵劑（德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌）混合添加發酵可制備成益生菌發酵乳，益生菌增加了發酵乳的功能性，而發酵乳也可作為益生菌的載體被人體攝入，繼而益生菌發酵乳受到廣泛關注[4]。然而，現階段益生菌發酵乳普遍存在貯藏期益生菌活菌數低，因為益生菌較發酵劑菌種易于衰亡，存在后酸化現象及乳清析出等問題，對其生產和消費造成不良影響[5]。目前雖有研究表明菊粉、低聚果糖能保護發酵乳中的益生菌，改善發酵乳品質，還可被人體攝入，產生益生元作用，但是缺乏系統地評價菊粉和低聚果糖對發酵乳的作用效果[4]。

本試驗中研究了不同添加量菊粉和低聚果糖對含雙歧桿菌BB-12 發酵乳品質的影響，包括發酵期黏度因子的變化與發酵時間，貯藏期間黏度、乳清析出率、滴定酸度、活菌總數與雙歧桿菌活菌數的變化。與傳統流變學觀測方法相比，采用DWS 理論，通過觀察發酵乳中顆粒的運動軌跡，在非破壞的條件下全過程檢測發酵乳發酵期的流變學的特性，包括黏度因子變化，參照已有發酵乳凝膠特性的研究，可分析發酵期間菊粉和低聚果糖對發酵乳的作用[7]。本試驗中通過研究不同聚合度的菊粉型果聚糖在發酵乳中的應用效果，為常見的含雙歧桿菌BB-12 的發酵乳選擇合適的菊粉型果聚糖，為含有其它益生元和益生菌的發酵乳的研制與生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低聚果糖（純度≥90%），上海源葉生物科技有限公司；菊粉（純度≥90%），美國國民淀粉公司；全脂乳粉，新西蘭恒天然集團；酸奶直投式發酵劑YF-L812、雙歧桿菌BB-12，丹麥科漢森股份有限公司；厭氧產氣包，三菱瓦斯化學株式會社；MRS 固體培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；莫匹羅星鋰鹽，青島海博生物技術有限公司；其它均為國產分析純試劑。

1.2 主要儀器、設備

光學法微流變分析儀，法國FORMULACTION儀器公司；PB-10 型酸度計，德國賽多利斯儀器有限公司；DV-2 數字式黏度計，上海尼潤智能科技有限公司；HC-2518R 冷凍離心機，安徽中佳科學儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化儀器有限公；THZ-98C 恒溫培養箱，上海福馬試驗設備有限公司；SX-500 蒸汽滅菌器，日本TOMY 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品配制 在含質量分數11.5%全脂乳粉的牛乳中，分別加入0.0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%及2.5%的低聚果糖（簡稱D）或菊粉（簡稱I），混勻后高壓均質處理（25 MPa）。經巴氏滅菌，按0.01%的添加量等量加入直投式發酵劑 （活菌數約9×108CFU/g）與雙歧桿菌BB-12（活菌數約6×108CFU/g）。將樣品置于42 ℃的培養箱內發酵，發酵終點為乳液pH 4.5。將樣品放入4 ℃冰箱貯藏。貯藏期樣品的測定時間為0，1，3，7，14 d 和21 d。

1.3.2 發酵終點時間的測定 采用pH 值計直接測量發酵期各樣品的pH 值。記錄不同菊粉或低聚果糖添加量對應的發酵乳達到發酵終點（pH4.5）所需時間。

1.3.3 發酵過程中微流變學觀測 凝膠體系形成過程中微流變學參數變化參考Titapiccolo 等[7]的方法，利用光學微流變儀監測。取20 mL 置于特制的平底圓柱形帶塞玻璃瓶中，再移至測定槽，于42 ℃下發酵，觀測彈性因子的變化。每隔1 min 采集1 次數據，根據1.3.2 節方法確定發酵時長。

1.3.4 發酵乳可滴定酸度的測定 稱量5 g 發酵乳樣品于錐形瓶中，加入40 mL 的煮沸并冷卻的蒸餾水與2 滴酚酞指示劑，搖勻后用0.1 mol/L 氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，30 s 內不褪色，記錄氫氧化鈉標準溶液所消耗的體積V（mL），V×20即發酵乳酸度（T°）[8]。

1.3.5 發酵乳黏度的測定 取發酵乳20 mL 于樣品槽中，待乳液溫度達到25 ℃后，根據樣品黏度范圍，使用21 號轉子，設置轉速20 r/min，開始測定后30 s 時記錄黏度值。當扭矩數值20%～90%時，所測定黏度值即發酵乳有效黏度值。

1.3.6 發酵乳乳清析出率的測定 稱取離心管的質量m0（g），然后倒入5～8 mL 的發酵乳樣品于離心管中，稱取離心管與發酵乳的質量m1（g）。于4 ℃，4 000 r/min 離心10 min，除去離心管內的上清液，最后稱取除去上清液后發酵乳與離心管質量m2（g）。根據以下公式換算得乳清析出率[9]。

WHC（%）=（m2-m1）/（m1-m0）×100%

1.3.7 發酵乳樣品活菌數計數 根據方改霞[10]、宋繼宏[11]、Akin S[12]等研究，改進國標GB 4788.35-2010《乳酸菌檢驗方法》[13]。稱取5 g 發酵乳于100 mL 錐形瓶中，加入45 mL 無菌生理鹽水并充分混勻，然后梯度稀釋。采用MRS 固體培養基傾注法，42 ℃厭氧培養培養48 h，計發酵乳中總的活菌數。采用含莫匹羅星鋰鹽的MRS 改良固體培養基傾注法，42 ℃厭氧培養48 h，計雙歧桿菌活菌數。上述菌落數準確計數范圍為30～300。

1.4 數據處理及試驗分析

用各指標測定值的3 個平行值進行數據分析，采用excel2013 的STDEV 與SAS9.4 的ANOVA 進行統計處理。圖形采用Orgin9.4 繪制。

2 結果與分析

2.1 菊粉和低聚果糖對發酵乳發酵時間的影響

由圖1可知，加入低聚果糖和菊粉延長發酵乳的發酵時間，在同一添加量下含有低聚果糖發酵乳的發酵時間長于菊粉。Oliveria 等[14]試驗表明，在含有乳雙歧桿菌發酵乳中，麥芽糊精可縮短發酵時間，低聚果糖和葡聚糖延長發酵時間。益生元對發酵時間的影響可能存在益生元種類的差異性。經方差檢驗發現，菊粉和低聚果糖發酵乳的發酵時間與其添加量之間差異性顯著（P = 0.0135＜0.05）。不同添加量低聚果糖和菊粉的發酵乳平均發酵時間分別為4.57 h 和4.5 h，而1.5%含量的低聚果糖或菊粉發酵乳的發酵時間與其它組分差異性不顯著。最終選擇含1.5%菊粉和低聚果糖的發酵乳及空白對照組做發酵期微流變學試驗。

2.2 菊粉和低聚果糖對發酵過程中黏度因子的影響

黏度是對發酵乳在一定溫度下形成的混合體組織狀態的綜合表現，黏度的變化也可用黏度因子表示。從圖2可看出菊粉和低聚果糖發酵乳及空白對照組的發酵是一個多級過程，包括低黏度初始停滯階段，黏度快速變化階段和高黏度階段[15]。在發酵前期兩個小時內各樣品黏度無明顯變化，屬于低黏度的初始停滯階段，此時乳酸菌生長繁殖代謝產酸，乳液中的pH 值逐漸降低。發酵兩個小時后，pH 值降到一定程度（通常為pH 值=5.0），此時酪蛋白膠粒開始解離，乳液中凝膠開始形成，進入黏度快速變化階段。對圖2拐點處分析得知三者開始產生凝膠的時間分別為：1.5%菊粉發酵乳2 h 23 min 40 s，1.5%低聚果糖的發酵2 h 28 min 30 s，空白對照組2 h 24 min 47 s。三者時間相近，因為在發酵乳發酵前期，凝乳的主要因素是德氏乳桿菌保加利亞亞種以乳糖為基礎，碳源大量生長繁殖代謝產酸，所以它們開始凝乳的時間基本相近。而后，各樣品黏度因子迅速增加至最大值，進入高黏度階段，這一階段包括酪蛋白膠粒鏈和膠粒簇延展形成蛋白質基質，脂肪球鑲嵌在蛋白質基質中，同時發酵劑乳酸菌產生胞外多糖，形成一張類似于肌原纖維細絲一樣的網，將微生物細胞和酸乳蛋白質基質連接起來，使得整個發酵乳形成較為穩定的凝膠體系[7，15]。其中菊粉發酵乳和空白樣的黏度有小范圍的降低，接著迅速回升，可能是由于形成的凝膠結構不穩定。最終三者黏度因子的大小關系是：低聚果糖發酵乳＞菌粉發酵乳＞空白發酵乳。

圖1 菊粉和低聚果糖對發酵乳發酵時間的影響Fig.1 Effect of inulin and oligofructose on fermentation time of fermented milk

圖2 添加量為1.5%菊粉和低聚果糖對發酵乳在發酵期間黏度因子的影響Fig.2 Effect of inulin and oligofructose with the addition of 1.5% on macroscopic viscosity index of fermented milk

2.3 菊粉和低聚果糖對發酵乳可滴定酸的影響

由圖3可見，不同添加量的菊粉和低聚果糖發酵乳在貯藏期間酸度不斷升高，主要是因為發酵乳中的乳酸菌保持一定的菌活力，代謝產酸。在貯藏期0 d 和1 d，菊粉發酵乳與低聚果糖發酵乳酸度高于空白樣。3～14 d，除了14 d 時質量分數為2.5%的菊粉發酵乳外，其它時間點測定的菊粉和低聚果糖發酵乳酸度均低于空白樣。貯藏期21 d，含菊粉發酵乳的酸度與空白樣相近，含低聚果糖發酵乳的酸度仍小于空白樣品。方差分析表明，菊粉和低聚果糖對發酵乳貯藏期酸度的影響差異性顯著（P=0.457＜0.05）；多重均值比較發現菊粉發酵乳酸度均值高于低聚果糖發酵乳。在低聚果糖發酵乳中，酸度與低聚果糖的濃度間差異性顯著（P=0.0073＜0.01），隨著低聚果糖濃度的增高，發酵乳的酸度逐漸降低。在菊粉發酵乳中，菊粉的濃度與發酵乳的酸度之間差異性不顯著（P=0.288＞0.01）；均值分析表明不同添加量菊粉的發酵乳酸度均小于空白樣品。虞嬌嬌等[8]也發現，在含瑞士乳桿菌的發酵乳中，添加一定量的低聚果糖可緩解發酵乳貯藏期的后酸化。后酸化的主要原因是乳酸菌代謝產酸。菊粉和低聚果糖可作為碳源被乳酸菌分解吸收，影響代謝產酸，也可作為親水性大分子物質對水分活度產生影響，進而通過影響酶活力間接影響乳酸菌的代謝[8]。

圖3 菊粉和低聚果糖對發酵乳貯藏期可滴定酸度的影響Fig.3 Effect of inulin and oligofructose on titratable acidity of fermented milk during storage time

2.4 菊粉和低聚果糖對發酵乳黏度的影響

由圖4可知，貯藏期內菌粉和低聚果糖發酵乳的黏度大于空白對照組。在0 d （發酵期結束時），低聚果糖發酵乳黏度均值大于添加菊粉發酵乳，這與2.2 節中黏度因子與時間的變化關系表現一致。1d 時各樣品黏度均降低，而3 d 后黏度升高并上、下波動，不同添加量的菊粉發酵乳黏度均值開始逐漸大于低聚果糖發酵乳。方差分析表明：菊粉發酵乳和低聚果糖發酵乳的黏度差異性顯著（P=0.0497＜0.05），且含有菊粉發酵乳的黏度均值大、波動小，菊粉發酵乳貯藏期間黏度較大程度地上升，這可能與菊粉本身的穩定性好，可形成一定的膠體結果有關[1，16-17]。低聚果糖的濃度對發酵乳黏度的影響極為顯著（P＜＜0.001），多重均值分析表明：當低聚果糖質量分數在0～1.5%時，發酵乳黏度與濃度呈正相關，這與虞嬌嬌[8]發現類似：在含瑞士乳桿菌的發酵乳中添加一定量低聚果糖增加黏度，當低聚糖濃度過高時，活菌數會增加，并且加大多糖的消耗量使發酸乳的黏度降低。低聚果糖質量分數高于1.5%后黏度出現波動仍大于空白對照組，而虞嬌嬌[8]對低聚果糖濃度設置的最大值僅為1.5%。本試驗中，當低聚果糖質量分數高于1.5%時，過多的低聚果糖補充了其被乳酸菌所消耗的量而增加發酵乳的黏度。對于菊粉而言，濃度對菊粉發酵乳黏度的影響也極為顯著 （P＜0.001）。多重均值分析表明，當菊粉質量分數大于1.5%時，發酵乳黏度均值高于空白對照組，且當菊粉添加量為1.5%時候黏度的均值最大。

圖4 菊粉和低聚果糖對發酵乳貯藏期黏度的影響Fig.4 Effect of inulin and oligofructose on viscosity of fermented milk during storage time

2.5 菊粉和低聚果糖對發酵乳清析出率的影響

乳清析出率是發酵乳微觀結構穩定的宏觀表現[9]。由圖5可知，低聚果糖和菊粉在發酵乳貯藏期均能降低乳清析出率，隨著貯藏時間的延長，各樣品的乳清析出率呈現波動式增加。方差分析表明菊粉和低聚果糖對發酵乳乳清析出率的影響差異性不顯著（P=0.1232＞0.05），低聚果糖發酵乳在貯藏期乳清析出率的均值略高于菊粉，因此菊粉具有相對較好地減少乳清析出作用。菊粉和低聚果糖的濃度對乳清析出率的影響差異性均極為顯著（P＜＜0.001）。多重均值比較發現添加量為1.5%的低聚果糖和1.5%，2.0%的菊粉發酵乳在貯藏期其乳清析出率控制在25%左右，具有較好的減緩乳清析出的效果。有研究表明，菊粉不僅能與發酵乳中蛋白質網狀結構結合增加結構性，還能形成微晶束，而微晶束能夠相互作用形成小的共聚體，可以鎖住更多的水分并增加持水力，這也是菊粉增加產品穩定性主要原因[16-17]。

圖5 菊粉和低聚果糖對發酵乳貯藏期乳清析出率的影響Fig.5 Effect of inulin and oligofructose on precipitate amount of whey of fermented milk during storage time

2.6 菊粉和低聚果糖對發酵乳活菌數的影響

由表1得知，參考雙歧桿菌的接種量6×108CFU/g，發酵期結束后各樣品中雙歧桿菌的活菌數隨著貯藏時間的增加而逐漸降低。菊粉和低聚果糖發酵乳中雙歧桿菌活菌數高于空白對照組，因此菊粉和低聚果糖能減緩雙歧桿菌的衰亡。菊粉和低聚果糖對貯藏期間發酵乳雙歧桿菌活菌數的影響顯著（P=0.049＞0.05）。多重均值檢驗發現菊粉減緩雙歧桿菌衰亡的效果優于低聚果糖，且在貯藏期后期14～21 d，菊粉發酵乳中雙歧桿菌的活菌數維持在108CFU/g，而低聚果糖僅107CFU/g，其中含有1.5%菊粉的發酵乳雙歧桿菌BB-12 活菌數均值最高。發酵乳中益生菌只有達到一定的數量才能保證其益生作用，比如日本要求為107CFU/g[18]。Akalin 等[19]發現0.5%與1.0%的低聚果糖對發酵乳中動物雙歧桿菌有發酵期增殖和貯藏期減緩衰亡的作用。本試驗中未發現低聚果糖在發酵期對雙歧桿菌BB-12 的增殖效果。Shakerian 等[20]研究發現菊粉也能顯著促進動物雙歧桿菌的增值。同樣Akin 等[12]研究表明菊粉能夠促進嗜酸雙歧桿菌增值。本試驗中僅發現菊粉對雙歧桿菌BB-12 的保護作用，可能是不同種類的雙歧桿菌存在代謝的差異性。本試驗均能驗證菊粉與低聚果糖對雙歧桿菌的保護作用。Buriti 等[21]通過體外消化模擬試驗發現含有菊粉對益生菌-嗜酸乳桿菌存在保護機制，推測這種保護一方面菊粉強化了嗜酸乳桿菌對不良環境的耐受性，另一方面菊粉形成微囊結構對益生菌直接保護。目前僅有研究證實菊粉形成凝膠結構把菌體包含在內，形成較為穩定的微觀結構，從而起到保護作用[22]。同樣，Ziar H 等[23]研究表明藻酸鈣與抗性淀粉結合后形成的微膠囊對發酵乳中的鼠李糖乳桿菌LBRE-LSAS 和雙歧桿菌BB-12 在消化系統中起保護作用。菊粉對益生菌的保護作用具有菌種及添加量的差異性。Mansour 等[24]發現在含有嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌的發酵乳中，菊粉對貯藏期動物雙歧桿菌有較好的保護作用，對嗜酸雙歧桿菌活菌數無顯著影響，且試驗中菊粉添加量為1.0%，小于Buriti[21]等的試驗中2.0%與4.0%的添加量。

由表2得知，發酵期結束后所有樣品中活菌總數超過109CFU/g，遠大于雙歧桿菌BB-12，說明在含雙歧桿菌BB-12 的發酵乳中，主要乳酸菌是發酵劑菌種。貯藏期活菌總數的變化類似于雙歧桿菌BB-12 活菌數的波動式下降。21 d 時，除了含有0.5%，1.0%，1.5%的菊粉的發酵乳活菌總數的維持在109CFU/g 以上，其它樣品中活菌總數均降至108CFU/g。Akalin 等[19]發現與本試驗結果相似，2.0%添加量的低聚果糖可減緩含有動物雙歧桿菌或長雙歧桿菌的發酵乳貯藏期發酵劑活菌數的衰亡。這不同于AkinS 等[12]的發現0.5%與1.0%添加量菊粉對含嗜酸雙歧桿菌發酵乳中的發酵劑活菌數無顯著影響，可能是菌種選擇及試驗方法存在一定差異性。本試驗中菊粉和低聚果糖對發酵乳中活菌數的影響差異性顯著（P=0.0072＜0.05），兩者的變化趨勢也不一樣。菊粉發酵乳在進入貯藏期0～1 d 內，活菌總數迅速降低，然后上、下波動下降，且各時間點活菌總數差異性不顯著；而低聚果糖發酵乳進入貯藏期0～1 d 內活菌總數迅速降低，然后3～7 d 內平緩下降，最后14～21 d 再顯著降低。多重均值檢驗表明，在貯藏期間含有0.5%菊粉發酵乳中活菌總數最高，與雙歧桿菌BB-12 活菌數最高對應的添加量不同，可能是由于不同濃度的菊粉對于不同的乳酸菌保護效果存在差異。

表1 菊粉和低聚果糖對發酵乳貯藏期雙歧桿菌BB-12 活菌數（108CFU/g）的影響Table 1 Effect of inulin and oligofructose on the viable count of Bifidobacterium BB-12（108CFU/g） of fermented milk during storage time

表2 菊粉和低聚果糖對發酵乳貯藏期活菌總數（108CFU/g）的影響Table 2 Effect of inulin and oligofructose on the viable count of all Lactobacillus（108CFU/g） of fermented milk during storage time

3 討論

菊粉和低聚果糖均能改善發酵乳的品質，菊粉作用效果優于低聚果糖。當菊粉添加量為1.5%時，貯藏期間發酵乳中雙歧桿菌BB-12 活菌數均值不低于108CFU/g，且維持在109CFU/g 以上。發酵乳黏度較高，乳清析出率較小，后酸化作用也較弱，發酵乳品質最好?？稍谶M一步工藝優化中，結合風味分析、感官評價綜合分析菊粉或低聚果糖的應用效果。

在發酵期內，菊粉發酵乳產酸迅速，低聚果糖發酵乳黏度大，而發酵期結束時通過乳清析出率判斷菊粉發酵乳更穩定。進入貯藏期后，菊粉發酵乳的黏度逐漸增加并大于低聚果糖發酵乳的黏度，二者的黏度與添加量之間差異性顯著；菊粉發酵乳的酸度大于低聚果糖發酵乳，低聚果糖發酵乳的酸度與低聚果糖添加量之間差異性顯著，而菊粉發酵乳則不顯著。通過乳清析出率可判定菊粉發酵乳結構更穩定。菊粉在發酵乳中并不是單一作為微生物碳源物質影響發酵乳品質，菊粉還可形成穩定菊粉膠簇結構對菌體進行保護，這與菊粉難以被微生物分解利用以及穩定性好的理化性質相對應。Torres 等[25]發現菊粉的顆粒在乳制品儲藏7 d 后粒徑從0.1 μm 增到10 μm 的現象，因此基于菊粉的聚集，可使得乳制品的黏性增加，此外菊粉也能降低貯藏期乳制品中蛋白質的水解程度，從而使產品有較高的穩定性[24]。由于低聚果糖易于被微生物分解利用，且分子質量小難以參與發酵乳中食品骨架構建，因此對發酵乳品質的影響可能是基于作為碳源被微生物分解利用和改變體系中水分活度。未來還可通過分析微生物代謝產物，以及菊粉和低聚果糖與蛋白質的相互作用方式，進一步探究不同聚合度的菊粉型果聚糖以及其它益生元對發酵乳品質的影響機理。