鋅指結構轉錄調控因子Sp8 廣泛分布于嗅球并在中間神經元表達

賀旭 ，葛金文，宋禎彥，余婧萍

（1湖南中醫藥大學中西醫結合學院，長沙 410208；2益陽醫學高等?？茖W校解剖教研室，益陽 413000）

鋅指結構轉錄調控因子Sp8 是鋅指轉錄家族的重要成員，主要表達在中樞神經系統和四肢[1,2]。作為一種重要的鋅指轉錄結構蛋白，Sp8可調控嚙齒類動物嗅球中間神經元的產生，而基因消融Sp8后嚴重減少生長激素抑制素中間神經元的表達[3]。我們先前研究表明Sp8在大鼠側腦室室管膜區（SVZ）有廣泛表達且可調控該區的神經發生及星形膠質干細胞分化[4]。SVZ區產生的神經祖細胞沿吻側遷移流以鏈狀方式遷移到嗅球，在嗅球顆粒細胞層（GCL）和突觸球層（GL）分化為中間神經元。本文擬進一步探討Sp8在成年大鼠嗅球各層的分布特點及與嗅球內的中間神經元的關系。

材料和方法

1 實驗動物

選擇4月齡健康雄性SD大鼠4只，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。所有動物飼養于室溫為（23±1）℃，相對濕度為55% 的動物房。整個實驗程序都通過湖南中醫藥大學倫理委員會的批準。

2 主要實驗儀器和試劑

珊頓低溫冰凍切片機（Shan Don 公司）、Olympus BX67熒光顯微鏡（奧林巴斯）、鼠抗Sp8 抗體（Santa Cruz公司）、兔抗calbindin（CB）抗體（Sigma公司）、兔抗parvalbumin（PV）抗體（Sigma公司）、兔抗tyrosine hydroxylase（TH）抗體（Sigma公司）。

3 組織學處理

給予SD大鼠麻醉，灌注取出腦組織。4℃后固定過夜，梯度沉糖。恒低溫冰凍切片機下采用鄰切法進行冠狀位切片，切片厚度為6μm。

4 免疫熒光單標染色法

選取6μm切片。PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；5%驢血清+0.1%TritonX-100磷酸鹽緩沖液室溫孵育2h；將腦片與鼠抗Sp8 （1:1000）孵育，4℃冰箱過夜；室溫下復溫30min，PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；Alexa Fluor 488偶聯驢抗鼠IgG （1:200）孵育2h；PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；雙苯酰亞胺（1:5000）染核10min；PBS-T溶液漂洗3次×5min/次；貼片，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并選取嗅球部位拍照。

5 免疫熒光雙標染色法

選取6μm切片。PBS-T溶液輕微漂洗3次×5 min/次；5%驢血清+0.1%TritonX-100磷酸鹽緩沖液室溫孵育2h；然后將腦片與以下3組抗體孵育：鼠抗Sp8（1:1000）與兔抗PV（1:1000）；鼠抗Sp8（1:1000） 與兔抗CB（1:1000）；鼠抗Sp8（1:1000）與兔抗TH（1:1000），置于 4℃冰箱過夜；室溫下復溫30 min，PBS-T溶液輕微漂洗3次，每次5 min；Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 594偶聯驢抗鼠、驢抗兔IgG（1:200）室溫孵育2h；接下來實驗步驟同免疫熒光單標染色法。

6 統計學處理

免疫熒光染色片子在目鏡×20下拍照，每套片子取相同的部位進行細胞計數，取均值。實驗數據以±s表示。細胞比率=（Sp8與中間神經元的共表達細胞/中間神經元）×100%。

結 果

1 Sp8廣泛表達于嗅球各層

Sp8免疫陽性細胞在成年大鼠嗅球的嗅神經層（ONL）、突觸球層（GL）、外叢狀層（EPL）、僧帽細胞層（MCL）、內叢狀層（IPL）和顆粒細胞層（GCL）6層中均有分布，陽性反應位于細胞核。其中，主要分布在MCL、IPL和GCL層，而EPL層的陽性細胞數最少（圖1）。

2 Sp8表達于嗅球大多數中間神經元

PV和CB陽性中間神經元主要分布于嗅球的EPL層（圖2和圖4），而TH陽性中間神經元主要分布于GL層（圖3）。上述3種類型的中間神經元胞體染色均明顯。此外，CB細胞之間還可見到有許多突起并相互聯系。細胞計數結果顯示，EPL層Sp8/PV細胞與PV細胞的比值為（90.6±7.2）%；EPL層Sp8/CB細胞與CB細胞的比值為（95.4±5.3）%；GL層Sp8/TH細胞與TH細胞的比值為（93.8±9.7）%。

討 論

嗅覺系統是感覺神經系統的一個重要組成部分，表現為動物依靠嗅覺識別同類、尋找食物、躲避天敵及占有領地，人類則通過嗅覺分辨各種氣味。主嗅球（main olfactory bulb, MOB）是嗅覺系統的重要組成部分，為同心排列的層狀結構，在嗅覺系統里充當第一級中轉站的作用。從內到外嗅球依次可分為6層：顆粒細胞層、內叢狀層、僧帽細胞層、外叢狀層、突觸球層和嗅神經層[5]。

嗅球神經元分為投射神經元和中間神經元兩大類，中間神經元的數量大約為投射神經元的100倍。嗅球中間神經元的產生需要神經祖細胞的增殖、遷移和分化，以及新生的中間神經元的成熟及遷移。在側腦室室管膜區神經干細胞及其直系子代中通過特定轉錄因子的表達調控神經元的分化，新分化的神經祖細胞通過吻側遷移流遷移到嗅球且被分化為球周細胞和顆粒細胞。因此了解嗅球神經發生的調控機制有助于我們理解嗅球的神經發育[6]。

研究顯示，鋅指結構轉錄調控因子Sp8可與側腦室室管膜區（SVZ）、海馬齒狀回顆粒細胞下層（SGZ）及大腦皮層淺層皮質的神經干細胞共表達，因此，Sp8被建議用來標記神經祖細胞[7]。本實驗結果顯示Sp8主要分布在顆粒細胞層、內叢狀層和僧帽細胞層，而在嗅球的嗅神經層、突觸球層和外叢狀層分布較少。Sp8對嗅球中間神經元的存活、遷移和分子分化起著重要作用，主要表現為敲除Sp8后嗅球內鈣網膜蛋白和GABA等中間神經元數量顯著減少[8]。此外，SP8還能與Sp9協調管理嗅球中間神經元的發育[9]。因此，我們接著探討Sp8與中間神經元的共表達情況。根據所表達的化學標記物的不同，嗅球內的中間神經元可分為小清蛋白（PV）細胞、鈣結合蛋白（CB）細胞和酪氨酸羥化酶（TH）細胞等[10]。免疫熒光雙標結果顯示，絕大部分中間神經元都表達了Sp8，這與Li等[11]報道的實驗結果一致。

圖1 Sp8免疫陽性細胞在成年大鼠嗅球的表達。ONL，嗅神經層；GL，突觸球層；EPL，外叢狀層；MCL，僧帽細胞層； IPL，內從狀層；GCL，顆粒細胞層；標尺，100μmFig. 1 Expression of Sp8-positive cells in olfactory bulb of the adult rats. ONL, olfactory nerve layer; GL, glomerular layer; EPL, external plexiform layer; MCL, mitral cell layer; IPL, internal plexiform layer; GCL, granule cell layer; scale bar, 100μm

圖2 成年大鼠嗅球Sp8與PV共表達的免疫熒光雙標檢測。A，Sp8/PV在嗅球EPL層的分布；B，A中a-c高倍圖像；a。-c。， Sp8陽性細胞；a’-c’，PV 陽性細胞；a’’-c’’，a。-c。與 a’-c’融合圖像；箭頭示雙標記細胞；標尺，100μmFig. 2 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with PV in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/PV cells in the olfactory bulb EPL layer; B, high magni fication images of a-c in A; a。-c。, Sp8 immunopositive cells; a’-c’, PV immunopositive cells;a’’-c’’ are merged images of a。 -c。and a’-c’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

圖3 成年大鼠嗅球Sp8與TH共表達的免疫熒光雙標檢測。A，Sp8/TH在嗅球GL層的分布；B，A中d-f的局部放大圖；d。-f。，Sp8陽性細胞；d’-f’，TH 陽性細胞；d’’-f’’，d。-f。與 d’-f’的融合圖像；箭頭示雙標記細胞；標尺，100μmFig. 3 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with TH in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/TH cells in the olfactory bulb GL layer; B, local high magni fication images of d-f in A; d。-f。, Sp8 immunopositive cells; d’-f’, TH immunopositive cells; d’’-f’’, merged images of d。-f。and d’-f’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

圖4 成年大鼠嗅球Sp8與CB共表達的免疫熒光雙標檢測。A，Sp8/CB在嗅球EPL層的分布；B，A中g-i為局部放大圖；g。-i。，Sp8陽性細胞；g’-i’，CB 陽性細胞；g’’-i’’ ，g。-i。與 g’-i’的融合圖像；箭頭示雙標記細胞；標尺，100μmFig. 4 Double-labeled immuno fluorescent examination for co-expression of Sp8 with CB in the adult rats olfactory bulb. A, the distribution of the Sp8/CB cells in the olfactory bulb EPL layer; B, high magni fication images of g-i in A; g。-i。, Sp8 immunopositive cells; g’-i’, CB immunopositive cells;g’’-i’’, merged images of g’-i。and g’-i’; arrows indicate the double-labeled positive cells; scale bar, 100μm

綜上所述，鋅指結構轉錄調控因子Sp8在成年SD大鼠的嗅球各層均有分布，且在其大多數中間神經元表達，可能參與了促進嗅球中間神經元的發育分化過程。