化痰通絡方含藥血清對血管內皮生長因子誘導的臍靜脈內皮細胞增殖的影響及其機制研究

邱明山 陳進春 林雙杰 錢麗霞 張少紅 李良成

【摘 要】目的：觀察化痰通絡方含藥血清對血管內皮生長因子（VEGF）誘導的臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖的影響及其機制。方法：將20只新西蘭兔隨機分為化痰通絡方高（HTTL-h）、中（HTTL-m）、低（HTTL-l）劑量組，雷公藤多苷組（TG組），生理鹽水組（Sal組），每組4只。分離鑒定健康新生兒HUVEC，siRNA敲降VEGFR2、PLCG1以及MAPK1，并采用RT-PCR和及Western Blot檢測VEGFR2、PLCG1和MAPK1 mRNA 及蛋白水平的表達。MTT法檢測經VEGF誘導的HUVEC增殖情況。結果：與Sal組比較，VEGF可顯著促進HUVEC增殖，而TG或HTTL-l均可顯著抑制VEGF誘導的HUVEC增殖;siRNA敲降VEGFR2后，VEGF則不能促進HUVEC增殖，同時TG也失去了對HUVEC增殖的抑制能力;siRNA敲降PLCG1后，VEGF依然可以顯著促進HUVEC增殖，此時TG對VEGF刺激的HUVEC增殖失去了抑制效應，但HTTL-m和HTTL-l依然對VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應;siRNA敲降MAPK1后，VEGF也可顯著促進HUVEC增殖，TG對VEGF刺激的HUVEC增殖具有抑制效應，同時HTTL-l也對VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應。結論：化痰通絡方含藥血清對VEGF誘導的HUVEC增殖具有抑制作用。TG抑制VEGF誘導的HUVEC增殖依賴于VEGFR2和PLCG1表達，而化痰通絡方對VEGF刺激的HUVEC增殖的抑制效應則不依賴VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號通路。

【關鍵詞】 關節炎，類風濕;化痰通絡方;血管內皮生長因子;臍靜脈內皮細胞;增殖;信號傳導通路

【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of serum containing Huatan Tongluo Fang（HTTL，化痰通絡方）on the proliferation of HUVEC induced by VEGF and its mechanism.Methods：Twenty New Zealand rabbits were randomly divided into the High（HTTL-h），medium（HTTL-m），low（HTTL-l） dose groups，the Tripterygium wilfordii glycoside group（TG group） and the saline containing serum group（Sal group），4 rabbits in each group.Healthy neonates HUVEC were isolated and identified，and siRNA knocked down VEGFR2，PLCG1，and MAPK1.RT-PCR as well as Western Blot were used to detect the expressions of VEGFR2，PLCG1，MAPK1 mRNA and protein levels.The proliferation of HUVEC induced by VEGF was detected by MTT.Results：Compared with the Sal group，VEGF could significantly promote HUVEC prolifer-ation，while TG or HTTL-l could significantly inhibit HUVEC proliferation induced by?VEGF.After siRNA knocked down VEGFR2，VEGF could not promote HUVEC proliferation，while TG also lost the inhibition of HUVEC proliferation.After siRNA knocked down PLCG1，VEGF could still significantly promote HUVEC proliferation，and at this time TG could not stimulate HUVEC proliferation stimulated by VEGF.However，HTTL-m and HTTL-l still had a significant inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF.After siRNA knocked down MAPK1，VEGF could also significantly promote HUVEC proliferation，TG had a inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF，and HTTL-l also had a significant inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF.Conclusion：The serum containing HTTL can inhibit the proliferation of HUVEC induced by VEGF.In TG group，the inhibition of HUVEC proliferation induced by VEGF depended on the expression of VEGFR2 and PLCG1，while the inhibition of HTTL on HUVEC proliferation stimulated by VEGF did not depend on the VEGF/VEGFR2/ PLCG1/ MAPK1 signal pathway.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;Huatan Tongluo Fang（化痰通絡方）;VEGF;HUVEC;proliferation;

signal transduction pathway

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以血管異常增生、關節滑膜炎為基本病理表現的自身免疫反應性疾病[1-2]。血管異常增生是RA滑膜炎和血管翳的基礎[2]，促進血管形成的最主要因子是血管內皮生長因子（VEGF）。VEGF可通過作用于關節滑膜內以及基底組織的微血管或毛細血管促進其增生[3]。筆者根據歷代醫家對痰、瘀致痹的認識，結合臨床觀察、治療實踐以及前期的實驗研究總結出痰濁、瘀血的病理變化貫穿于RA的發病過程，并以化痰通絡方治療RA，在動物實驗及臨床試驗中取得了較好的療效[4-5]。在前期動物實驗中，筆者發現化痰通絡方能抑制膠原誘導性關節炎大鼠關節滑膜組織VEGF和VEGFR2表達，進而抑制血管增生和血管翳的形成[6]。本研究中，筆者利用體外培養的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），通過敲降VEGFR2/PLACG1/MAPK1觀察化痰通絡方抑制血管增生的潛在機制，以期能進一步了解化痰通絡方發揮作用的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與細胞 雄性新西蘭兔20只，體質量（2.0±0.5）kg，動物許可證號SCXK（滬）2012-0011，由廈門大學動物實驗中心提供，動物實驗獲得廈門大學動物倫理委員會審查。細胞株：獲得健康志愿者簽署知情同意書，通過健康新生兒臍帶分離培養HUVEC。健康新生兒臍帶，由福建中醫藥大學附屬廈門市中醫院產科提供。

1.2 藥品與試劑 化痰通絡方（膽南星10 g、桃仁10 g、僵蠶10 g、白芥子10 g、白芍15 g，以上中藥飲片均由康美藥業有限公司生產，為同一批號產品）。雷公藤多苷片（TG，福建匯天生物藥業有限公司，國藥準字Z35020431，規格10 mg/片）;

cDNA合成逆轉試劑盒（Thermo Fisher Scientific，K1622）;TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，K10225）;DAB染色（福州邁新生物技術開發公司）;siRNA利用Thermofisher提供的在線設計工具進行設計，并在上海吉馬生物技術公司合成。

1.3 儀 器 PCR儀（Bio-Rad，S1000）;倒置顯微鏡（Olympus，BX53F）;顯微照相系統（Olympus，U-TV05XC-3）;電熱恒溫水浴箱（上海精宏，DK-8D）;超凈工作臺（蘇凈安泰）;自動酶標儀（Bio-Rad，iMark）;流式細胞儀（EPICS ALTRA）;-80℃低溫冰箱（Thermo Scientific，8920）。

2 方 法

2.1 化痰通絡方含藥血清的制備 將20只新西蘭兔隨機分為化痰通絡方高（HTTL-h）、中（HTTL-m）、低（HTTL-l）劑量組，TG組和生理鹽水組（Sal組），每組4只。分別灌胃化痰通絡方、TG、Sal，每日早、晚各灌胃1次。實際灌胃劑量按動物體表面積換算得出，每公斤體質量每日灌胃量為1，5，10倍臨床等效劑量，HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l組按4.5 g·kg-1·d-1、22.5 g·kg-1·d-1、45 g·kg-1·d-1灌胃化痰通絡方，TG組按7.35 g·kg-1·d-1灌胃TG，連續灌胃3 d，禁食12 h后灌胃1次（1 d的量），共灌7次，1 h后乙醚麻醉動物，無菌條件下心臟采血。將抽取的血液室溫下靜置3 h，離心，取上清，56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝-80 ℃保存備用。

2.2 HUVEC的培養 HUVEC分離培養采用阮溦等[7]改良的方法。取健康新生兒臍帶，以Ⅱ型膠原酶消化，離心分離后加入完全培養基（M199、體積分數為10%的優質胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、質量分數為6.67%的HEPES、8 ng·mL-1 VEGF）培養。對培養的HUVEC進行形態學和免疫細胞化學及流式細胞檢測，選取CD106陰性、CD31陽性率 > 99%的HUVEC進行后續實驗。

2.3 MTT法檢測化痰通絡方含藥血清對VEGF誘導的HUVEC增殖

2.3.1 實驗分組 將HUVEC分為以下7組：HUVEC組，HUVEC + VEGF組，HUVEC + VEGF +?Sal組，HUVEC + VEGF + TG組，HUVEC + VEGF + HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l劑量組。

2.3.2 各組細胞處理 在實驗中分別對不同濃度的VEGF、血清探討，最終選擇12.5 ng·mL-1的VEGF與體積分數為5%的血清進行后續實驗。取上述培養的HUVEC，質量分數為0.05%的胰酶消化后接種于96孔培養板，5000細胞/孔，用含體積分數為10% FBS的M199培養液培養24 h，分別加入質量分數為5%的Sal血清，質量分數為5%的TG含藥血清及HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l組質量分數為5%的化痰通絡方含藥血清，每組均設復孔3個，培養4 h。加入12.5 ng·mL-1 VEGF 再分別培養12，24，48 h。

2.3.3 MTT法檢測HUVEC增殖 棄原培養液，每孔加入100 μL無血清培養液，30 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），37 ℃培養4 h。200 μL DMSO溶解，振蕩混勻。在自動酶標儀上波長490 nm處檢測吸光度值。細胞增殖率 = （實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.4 siRNA下調VEGFR2、PLCG1和MAPK1的表達 分別設計、優化了敲降VEGFR2、PLCG1以及MAPK1的siRNA 序列（見表1）。用羅氏X-treme GENE siRNA 轉染試劑將上述siRNA序列分別轉染HUVEC，72 h后，胰酶消化，收細胞-80 ℃凍存，分別進行RT-PCR和Western Blot檢測敲降效率。

2.5 RT-PCR檢測siRNA 敲 降效率 取上述凍存細胞，加入1 mL Trizol按照常規方法提取總RNA。依據MBI Fermentas的逆轉錄試劑說明書，將RNA逆轉為cDNA，然后利用表2引物分別按下述條件進行PCR反應。循環參數均為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31個循環后，72 ℃延伸10 min。GAPDH為內參。見表2。

2.6 Western Blot檢測siRNA敲降效率 提取各組細胞總蛋白，用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒測定各組樣本蛋白質濃度，樣品蛋白經SDS-PAGE電泳、轉膜、加入一抗（VEGFR2、PLCG1和MAPK1）和二抗（IgG）、顯影、成像。

2.7 MTT檢測化痰通絡方含藥血清對經RNA干擾VEGFR2、PLCG1和MAPK1的HUVEC增殖 方法同2.3.3。

2.8 觀察化痰通絡方含藥血清對VEGF誘導的HUVEC血管環形成的影響 將Matrigel基質膠放置4 ℃冰箱中過夜融化，在預冷的48孔板中加入60 μL稀釋的Matrigel基質膠溶液，37 ℃放置40 min使溶液凝固。然后每孔加入無血清RPMI 1640培養液稀釋的HUVEC（1.5×104/孔）凝膠表面，37 ℃，體積分數為5%的二氧化碳培養箱中繼續培養12 h。分別加入體積分數為5%的Sal血清，質量分數為5%的TG含藥血清及HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l劑量組質量分數為5%的含藥血清，每組均設復孔3個，培養4 h。加入12.5 ng·mL-1 VEGF再分別培養48 h。倒置顯微鏡下觀察血管環形成，每孔隨機選取5個視野，拍照，計數血管環，并統計結果。

2.9 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，采用單因素方差分析及t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 HUVEC鑒定及對VEGF敏感性測定 HUVEC進行CD106（間充質干細胞標志）及CD31（血管內皮細胞標志物）鑒定，結果如圖1所示，筆者所分離到的細胞CD31陽性（陽性率99%以上）而無間充質干細胞污染（CD106陰性）;同時，分離的HUVEC對VEGF的應答能力在12.5 ng·mL-1，

25 ng·mL-1時均可顯著促進HUVEC增殖，見表3;因此，后續實驗筆者選擇12.5 ng·mL-1為VEGF的劑量刺激HUVEC;為了觀測含藥血清對HUVEC增殖的影響，筆者也探討了2.5%、5%及10%體積分數的正常兔血清對VEGF誘導的HUVEC增殖，在培養的12，24，48 h內均無顯著影響，見表4。所以選擇兔血清體積分數為5%的含藥血清進行后續實驗。

其后筆者檢測了siRNA分別下調HUVEC中VEGFR2、PLCG1和MAPK1后，化痰通絡方含藥血清對HUVEC增殖的影響。結果顯示，SCR組VEGF可顯著促進HUVEC增殖（P < 0.05），而TG或HTTL-l含藥血清均可顯著抑制VEGF誘導的HUVEC增殖（P < 0.01）;siRNA敲降VEGFR2后，VEGF則不能促進HUVEC的增殖（P > 0.05），同時TG含藥血清也失去了對HUVEC增殖的抑制能力。提示VEGF刺激的HUVEC增殖依賴于VEGFR2的表達，而TG發揮作用也依賴于VEGF-VEGFR2信號通路;siRNA敲降PLCG1后VEGF依然可以顯著促進HUVEC增殖（P < 0.01）。提示VEGF/VEGFR2激活后存在不依賴于PLCG1而促進HUVEC增殖的信號通路;此時，TG對VEGF刺激的HUVEC增殖失去了抑制效應。但HTTL-m、HTTL-l含藥血清依然對VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應（P < 0.05）。siRNA敲降MAPK1后VEGF也可顯著促進HUVEC增殖（P < 0.05），TG對VEGF刺激的HUVEC增殖具有抑制效應（P < 0.01），同時HTTL-l含藥血清也對VEGF刺激的HUVEC增殖具有顯著抑制效應（P < 0.01）。提示存在不依賴于PLCG1以及MAPK1的VEGF/VEGFR2促進HUVEC增殖的信號通路;TG抑制VEGF刺激的HUVEC增殖依賴于VEGFR2以及PLCG1的表達;而化痰通絡方含藥血清對VEGF刺激的HUVEC的增殖不依賴于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號通路。見圖4。

3.4 化痰通絡方含藥血清可顯著抑制VEGF誘導的HUVEC血管環形成 為了進一步闡明化痰通絡方對血管形成的影響，筆者觀察了HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l含藥血清對VEGF誘導的HUVEC血管環形成的影響。結果顯示，與Sal組比較，TG含藥血清可顯著抑制VEGF誘導的血管環形成;HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l含藥血清也可顯著抑制VEGF誘導的血管環形成，且呈劑量依賴性。見圖5、圖6。

4 討 論

4.1 血管增生在RA 發病中的作用 RA主要病理變化為關節滑膜炎癥細胞浸潤、血管翳形成。血管異常增生是RA慢性增生性滑膜炎和血管翳的基礎[1-2]。血管的生成受血管生成刺激因子及抑制因子的雙重調節，即血管生成平衡假說，當血管生成刺激因子異常增高時，這種平衡被打破，出現病理性血管增生。RA血管病理性增生中最重要的促進血管形成的因子是VEGF[3]。中和VEGF可抑制膠原誘導的小鼠關節炎的發生[8]，表明VEGF所誘導的血管增生在RA發病中具有非常重要的作用。

4.2 化痰通絡方的組方原則及現代藥理研究 痰、瘀作為各證型共性的病理變化貫穿于RA整個發病過程，痰濁瘀血既是機體在致病因素作用下的病理產物，又可作為致病因素作用于機體。因此，筆者提出了RA以疏暢氣機、化痰活血為主要治法的化痰通絡法，應貫穿于治療的始終?；谏鲜鲇^點，筆者選取膽南星、桃仁、白芥子、僵蠶、山慈菇作為化痰通絡方的藥物組成。南星“治痰功同半夏”，但半夏雖屬辛散，專理脾胃濕痰，而南星辛散之力勝過半夏，專主經絡風痰;膽南星為南星經過牛膽汁炮制，燥性已減，性味苦涼，兼清痰熱，對于痰瘀郁熱更為妥當。桃仁味苦，入心肝血分，活血散瘀之力強，有推陳致新之功[9]。兩者同用，有化痰祛風、消腫散結、活血化瘀、通絡止痛之功，共為君藥。白芥子溫通經脈、消腫散結加強膽南星化痰通絡之力，而為臣藥。僵蠶化痰散結、滌化痰濁、祛風止痛，助膽南星化痰祛風通絡之力，白芍養血柔肝、緩急止痛，兩藥均為佐使藥。全方共奏化痰活血、通絡蠲痹之功。

本項研究中，筆者應用MTT、Western Blot、RT-PCR、質粒轉染等技術，以TG為陽性藥，觀察了化痰通絡方含藥血清對VEGF誘導的HUVEC增殖的影響。結果顯示，TG和化痰通絡方均能夠抑制VEGF誘導的HUVEC增殖和血管環形成，同時應用siRNA分別下調HUVEC中VEGFR2、PLCG1后，TG不能阻斷VEGF誘導的HUVEC的增殖和血管環形成;而siRNA下調HUVEC中VEGFR2、PLCG1和MAPK1后，化痰通絡方含藥血清可完全阻斷VEGF誘導的HUVEC的增殖。提示TG抑制VEGF刺激的HUVEC增殖依賴于VEGFR2以及PLCG1的表達，而化痰通絡方抑制VEGF刺激的HUVEC的增殖不依賴于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號通路。

綜上所述，筆者認為，化痰通絡方能夠抑制VEGF誘導的HUVEC增殖和血管環形成，但其作用機制不依賴于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信號通路。

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收稿日期：2019-08-27;修回日期：2019-10-25