柿葉黃酮納米脂質體的制備工藝優化*

霍元子，屈懷東，王連艷，徐世一，閻雪瑩

（1.黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱150040；2.中國科學院過程工程研究所，北京100089）

柿葉為柿樹科柿樹屬植物柿的新鮮或干燥葉[1]。由于柿葉中所含的黃酮類化合物（PLF）有明顯的藥理活性、確切的臨床療效，其在抗菌消炎、清熱解毒、抗氧化、抗惡性腫瘤、抗心腦血管疾病等領域有廣闊的應用前景。目前，以PLF為主要有效成分的中成藥（腦心清片）已應用于臨床[2,3]。由于其脂溶性較低，而脂質體作為給藥載體能夠有效地解決水溶性藥物的脂溶性問題，提高藥物跨膜轉運的能力?？ú吩谳^寬pH值范圍內可以保持相對穩定且具有一定的生物粘附性，能夠相對地延長藥物在吸收位點的作用時間，從而改進口服藥物的療效[4]。本論文采用UV-Vis對柿葉中總黃酮進行測定，為研究制備新型柿葉黃酮脂質體（PLF-Lip）制劑提供理論基礎，也為進一步探索應用于臨床的新型納米給藥系統提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

UV9100CPC型紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）；JEOL-2010型透射電子顯微鏡（日本島津公司）；Nano-ZS90型激光粒度-電位分析儀（馬爾文儀器有限公司）；Scientz-IID型超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MD-200-2型氮氣吹干儀（天津恒奧科技有限公司）。

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院 批號：100080-201610）；PLF提取物（西安開來生物工程有限公司，純度≥80%）；大豆卵磷脂（國藥集團化學試劑有限公司），膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司），卡波姆（北京迪馬科技有限公司），殼聚糖（北京迪馬科技有限公司），聚維酮（國藥集團化學試劑有限公司），HAc等其他試劑為分析純。

1.2 方法

UV-Vis是測定PLF最為簡便高效的方法。由于本研究所采用的PLF（黃酮含量≥80%）還含有其他成分，為便于PLF的定量分析，選擇蘆丁作為指標性成分，測得的理化性質數據實際是蘆丁的理化性質指標。

1.2.1 PLF-Lip的制備 精密稱取處方量的脂質材料和PLF，置于茄型瓶中，加入一定量的無水乙醇使其完全溶解。將茄形瓶置于旋轉蒸發儀上，于40℃、50r·min-1旋轉除去無水乙醇至無醇味，通入2h N2，靜置過夜，除盡有機物。加入適量去離子水和若干玻璃珠，水化2h，水化液依次經過0.45、0.22μm有機濾膜濾過即得。

1.2.2 處方設計與篩選 以PLF-Lip的EE%和DL%為評價指標,通過單因素考察藥脂比、PC∶Ch的值（卵磷脂與膽固醇的質量比）、磷脂濃度（CPC）、水化介質的種類、水化介質的pH值5個因素對PLF-Lip EE%和DL%的影響,針對關鍵因素進行正交實驗的優化[5]。

1.2.3 UV-Vis檢測方法的建立

1.2.3.1 檢測波長的確定 取對照品溶液和供試品溶液適量，以不含蘆丁、PLF的溶液作空白溶劑，在200～600nm波長范圍內進行掃描，記錄最大吸收波長。如圖1，對照品溶液、供試品溶液均在362nm位置有最大的吸收峰，參照2015版《中國藥典》，最終檢測波長確定為362nm[6]。

圖1 蘆丁對照品、PLF供試品的最大吸收波長Fig.1 Maximum absorption wavelength of rutin standard and persimmon leaf flavonoid sample

1.2.3.2 線性關系考察 取對照品溶液用95%乙醇稀釋，配成濃度（C）為25.000、20.000、12.500、6.250、3.125μg·mL-1的5組蘆丁對照品溶液，于362nm波長處測定吸光度（A）。并以C為橫坐標，A為縱坐標進行線性回歸，得方程：A=0.0281C+0.0150（R2=0.9992）。表明蘆丁對照品在3.125～25.000μg·mL-1的濃度范圍內線性關系良好。方法學考察中結果均符合2015年版《中國藥典》的相關規定。

1.2.3.3 含量測定 精密量取適量的供試品溶液，稀釋適當倍數，利用UV-Vis在362nm處檢測A，利用蘆丁標準曲線計算濃度。結果表明，以蘆丁計PLF提取物中總黃酮含量約為84.32%。

1.2.3.4 驗證試驗 按得出的最佳工藝處方平行制備3批PLF-Lip，測算的EE%分別為83.5%、85.2%、86.1%，RSD%結果為1.55%，說明優化的處方工藝可靠。

1.2.4 包衣PLF-Lip的制備

1.2.4.1 制備 在預試驗中對包衣材料進行了篩選，選定卡波姆作為本次試驗的包衣材料，將新鮮制備的PLF-Lip與等體積一定濃度的卡波姆溶液混合，45r·min-1磁力攪拌30min，再孵育30min。4℃冰箱中靜置過夜，即得卡波姆包衣的PLF-Lip。

1.2.4.2 卡波姆濃度對相對包衣率（CR%）的影響配制0.0、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0g·L-1的卡波姆包衣液，制備6組不同濃度卡波姆包衣的PLF-Lip。稀釋適當倍數于510nm處檢測卡波姆包衣的PLF-Lip的吸光度（A），按照下式計算CR%。以10.0g·L-1卡波姆的包衣率計為100%，其他濃度的CR%見表4。

式中AL：PLF-Lip的吸光度；A10：10g·L-1卡波姆包衣脂質體的吸光度；AL和A10：固定值。

2 結果和討論

2.1 單因素考察

通過單因素考察藥脂比、PC∶Ch的值、水化介質的pH值、CPC和介質種類這5個因素，以EE%和DL%為評價指標，確定主要影響因素，再通過正交設計試驗，以EE%為單一評價指標，確定最終的最佳優化處方。實驗結果見圖2。

確定藥脂比為1∶20、PC∶Ch為10∶1、CPC=10mg·mL-1、水化介質的pH值為7.0，由于介質種類對兩種指標的影響較小，且考慮到制劑成本，最終選擇去離子水作為水化介質。

圖2 單因素考察結果圖Fig.2 Single factor investigation result chart

2.2 正交實驗優化處方

2.2.1 因素與水平 通過單因素考察初步確定藥脂比（A）、PC∶Ch的值（B）、水化介質的pH值（C）和CPC（D）這4個主要影響因素，為進一步整體分析這些因素對EE%的影響，正交設計優化處方工藝。且每組因素設置3個水平，見表1。

表1 因素-水平表Tab.1 Table of factor-level

2.2.2 結果分析 按正交表中的9組處方完成實驗操作，正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

各種因素對EE%的影響由大到小的順序均為：B＞D＞A＞C，在實驗所選的因素中，水化介質的pH值對EE%的影響作用最小，藥脂比對EE%的影響作用最大。因此依據統計學分析結果，并兼顧藥物穩定性和經濟性原則，優化制備處方為B2D3A2C2。確定藥脂比為1∶20、PC∶Ch=10∶1、CPC=15mg·mL-1，水化介質為pH值為7的去離子水。

表2 正交設計表及包封率結果（n=3）Tab.2 Orthogonal design table and encapsulation results（n=3）

表3 包封率的方差分析表Tab.3 Variance analysis table for encapsulation rate

2.3 包衣材料濃度的選擇

表4 卡波姆濃度對CR%的影響（n=3）Tab.4 Effect of carbomer concentration on CR%（n=3）

實驗數據顯示，隨著卡波姆濃度的增加，PLFLip的CR%升高。說明在PLF-Lip的外層包上了卡波姆衣層。穩定性考察實驗結果中，在保證不改變物理穩定性、EE%的前提下，確定以5g·L-1的卡波姆溶液作為最終的包衣材料。

2.4 表征

2.4.1 外觀及TEM觀察結果（圖3）按最佳工藝制備的卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip，用肉眼觀察為白色乳狀混懸液，均勻且未見不溶性顆粒物。將樣品置于TEM下觀察呈橢球型囊泡結構，外形圓整，粒徑大小與粒度分析儀測出結果吻合。

圖3 Oral-PLF-Lip的外觀（a）和TEM觀察結果（b）Fig.3 Appearance of Oral-PLF-Lip（a）and TEM observation results（b）

2.4.2 粒徑和電位（圖4） 采用納米粒徑及Zeta電位分析儀對卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip的粒徑和Zeta電位進行分析。平均粒徑為（257.2±9.3）nm，帶有負電性，電位為（-47.1±2.2）mV，分布均勻，有良好的穩定性。

圖4 Oral-PLF-Lip的粒徑（a）和Zeta電位（b）分布圖Fig.4 Distribution diagram of particle size（a）and Zeta potential（b）of Oral-PLF-Lip

圖4 （a）的橫軸取值范圍縮小點；（b）的橫軸從-100～100范圍內作圖。

3 結論

本研究以PLF為模型藥物，優化了PLF-Lip的制備工藝，采用TFD-孵育法成功制備了卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip，主藥用量為10mg，藥脂比1∶20，卵磷脂∶膽固醇（PC∶Ch）=10∶1，磷脂濃度（CPC）為15mg·mL-1，包衣材料濃度5g·L-1，透射電鏡下該脂質體呈現橢球形囊泡結構，外觀均勻圓整。平均Zeta電位為（-47.1±2.2）mV，平均粒徑為（257.2±9.3）nm。該處方工藝適用于口服包衣柿葉黃酮納米脂質體的制備。為PLF能夠更好地跨膜吸收從而提高生物利用度、提高療效奠定了一定基礎。