TUBB8基因突變致早期胚胎發育停滯一例

李文澍，劉雪梅

一次成功的臨床妊娠需要經歷卵母細胞成熟、精卵細胞融合及胚胎發育等過程，而減數分裂和有絲分裂的正常進行是卵母細胞成熟和早期胚胎正常發育的基礎條件之一。在細胞分裂過程中同源染色體通過微管組織中心呈對稱排列，在兩極紡錘體的牽引下染色體分裂形成下一級細胞，而紡錘體組裝及染色體分離都離不開微管蛋白的基礎作用，其中TUBB8是一種特殊的微管蛋白亞型，在人類卵母細胞和早期胚胎細胞中發揮著重要作用[1-2]。既往研究表明TUBB8基因發生突變會導致卵母細胞成熟障礙、受精障礙和早期胚胎發育停滯等[3-4]?，F報告1例TUBB8基因突變型導致患者反復早期胚胎發育停滯的臨床病例。

1 病例報告

患者 女，36歲，因婚后未避孕未孕10年，于2018年10月7日就診于我院生殖醫學中心。平素月經規律，周期30 d。體質量指數（BMI）21.6 kg/m2，抗苗勒管激素（AMH）2.634 ng/mL（1 ng/mL=7.14 pmol/L）?；A性激素水平和甲狀腺功能未見明顯異常。子宮輸卵管造影（HSG）示：宮腔顯影正常，雙側輸卵管顯影，盆腔造影劑彌散局限。染色體核型為46，XX。2018年10月31日因超聲發現宮腔內異?；芈曈谖以盒袑m腔鏡檢查術+宮腔鏡下子宮內膜息肉切除術，術中見：左側輸卵管開口處可見5 mm×3 mm息肉，宮腔前后壁遍布息肉樣增生；術后病理回報為子宮內膜息肉。男方39歲，BMI25.1 kg/m2。精液常規示弱精子癥、畸形精子癥。染色體核型為46，XY。因甲狀腺功能減退口服優甲樂治療。雙方均無不良生活習慣及嗜好，未從事生殖毒性的相關工作。

2018年12月—2019年12月患者于我院生殖醫學中心進行了4個體外受精/卵細胞質內單精子注射（IVF/ICSI）周期的助孕治療。①2018年12月24日行第1周期：控制性超促排卵（COH）方案采用拮抗劑方案，當有1個以上優勢卵泡直徑大于18 mm或2個以上優勢卵泡直徑大于17 mm時，肌內注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）6 000 IU扳機，34～36 h后取卵，共獲卵4枚。男方當日因精液量少，精子濃度低，進行了2次取精，2次精液合并處理后行IVF受精。受精后2 h實驗室觀察見2枚卵母細胞排出第二極體，第2日（D2）觀察未見2原核（2PN）的受精卵，第3日（D3）觀察見2枚受精卵形成3細胞的胚胎，因未形成可移植胚胎取消周期。②2019年2月25日行第2周期：COH方案采用卵泡期長效長方案助孕，月經第3天給予促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa，達菲林）3.75 mg肌內注射，注射后33 d超聲及性激素檢查示卵巢卵泡處于基礎狀態，每天給予FSH（麗申寶）300 IU及重組人生長激素4 IU。扳機后34～36 h取卵，共獲卵8枚。IVF受精后2 h觀察見5枚卵母細胞排出第二極體，D2觀察未見2PN的受精卵，D3觀察有2枚受精卵卵裂分別形成8細胞和5細胞的胚胎，移植后未孕。③2019年6月22日行第3周期：COH方案采用長方案助孕，扳機后34～36 h取卵，共獲卵5枚。由于前2個周期IVF后見第二極體排出，但D2未觀察到PN形成，因此本周期給予ICSI+卵母細胞激活助孕。D2實驗室觀察見5枚卵母細胞均形成2PN的受精卵，D3觀察見其中4枚受精卵發生卵裂形成3～5細胞的卵裂期胚胎，移植1枚4細胞和1枚5細胞的胚胎后未孕，剩余2枚胚胎行囊胚培養未形成囊胚。④2019年11月27日行第4周期：COH方案采用拮抗劑方案，加用生長激素，采用肌內注射hCG4 000 IU+短效GnRHa（曲普瑞林）0.2 mg雙扳機，34～36 h后取卵，共獲卵8枚。本周期仍采用ICSI+卵母細胞激活助孕。D2實驗室觀察見8枚卵母細胞均形成2PN的受精卵，D3觀察見7枚受精卵卵裂形成卵裂期胚胎，移植1枚8細胞和1枚4細胞的胚胎后未孕，剩余5枚胚胎行囊胚培養未形成囊胚。見表1。2020年6月對夫婦雙方進行了全外顯子的測序（復旦大學生命科學學院）。結果經Sanger測序確認女方存在TUBB8基因的雜合突變——TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser，見圖1；男方未發現突變基因。

表1 患者的IVF+ICSI臨床結果

圖1 TUBB8基因突變定位

2 討論

該患者有10年不孕病史，在排除了其他不孕相關因素后，患者首先進行了2個周期的IVF治療。無論是實施拮抗劑方案還是卵泡期長效長方案，患者雖有成熟卵母細胞形成，但在隨后的受精及胚胎早期分裂結果均不理想。由于男方存在弱精子癥、畸形精子癥，首先考慮到精子質量影響胚胎質量的可能，遂更改方案，后2個周期采用ICSI方式，并加用了改善卵母細胞質量的相應措施。結果表明，成熟卵率與卵裂期胚胎形成率均得到改善，但最終所有胚胎的發育仍停滯在了8細胞期，并伴隨胚胎碎片化。綜合4個助孕周期，患者均能生成成熟卵母細胞，但存在卵母細胞受精障礙及早期胚胎發育停滯的情況，并通過查閱文獻，追蹤以往相似研究案例結果，可以得知存在于卵母細胞中的母體RNA與蛋白質在受精卵形成后仍會對胚胎發育有影響，母體基因突變可能是導致早期胚胎發育停滯的主要原因之一[5]，遂對患者及其配偶進行了全外顯子的測序，由此發現了突變基因型TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser。

在卵母細胞和早期胚胎中，TUBB8基因是微管蛋白系列最重要的表達基因之一，而在減數分裂和有絲分裂過程中紡錘體組裝和染色體分離都離不開微管蛋白的基礎作用[2]。TUBB8基因只存在于靈長類動物中，本身為高度保守的基因型，而基因錯義突變會影響a/β微管蛋白等二聚體的折疊與組裝，改變了體內微管蛋白的動力學，使紡錘體發生組裝缺陷，并最終使卵母細胞和早期胚胎發育停滯[6]。文獻報道目前已發現82種TUBB8變異基因型[7]，不同變異基因型會呈現不同的臨床表型，包括：①形成的未成熟卵母細胞發育完全停滯；②形成無法受精的MⅡ期卵母細胞；③形成無法卵裂的受精卵；④形成的早期胚胎發育停滯；⑤形成外觀正常但反復植入失敗的胚胎[8]。大多數TUBB8致病變異基因型發生在中國[9]。本研究所闡述的TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser的雜合子突變屬于新發現的突變型，未在既往的文獻中報道過，該基因型呈現的臨床表型為早期胚胎發育停滯，無法進一步培養成正常的囊胚。

自從2016年Feng等[3]首次證明TUBB8基因突變會導致卵母細胞成熟障礙和早期胚胎發育障礙，此后有相關研究證明了TUBB8基因突變導致的早期胚胎發育停滯。研究表明某些TUBB8突變患者可以形成MⅡ期卵母細胞，且能正常受精和卵裂，但形成的所有胚胎發育都停滯在2細胞期～8細胞期[10-11]。推測患者早期胚胎發育停滯的原因可能是TUBB8基因突變影響了卵母細胞減數分裂中紡錘體的形成與組裝，使染色體不均勻分裂，雖然有的卵母細胞可以成熟形成MⅡ期卵母細胞，但受精后可能形成非整倍體胚胎，導致胚胎無法繼續正常發育[4，12]。Jia等[10]最新的研究闡述了另一種有關TUBB8基因突變導致胚胎發育停滯的機制，揭示了TUBB8基因中1個新的雜合突變（c.1041C>A；p.N347K），該突變可干擾有絲分裂紡錘體組裝和染色體排列使早期胚胎發育停滯，該研究將人TUBB8突變基因型cDNA注入小鼠的2PN受精卵中，突變基因型TUBB8 cDNA直接阻斷了受精卵的第一次有絲分裂，使97%的受精卵細胞無法形成功能正常的紡錘體，而在注射TUBB8正?；蛐蚦DNA后紡錘體長度和胚胎形成率得到了明顯改善。Yuan等[11]的研究亦指出TUBB8基因突變引起的微管缺陷可導致紡錘體排列不規則，進一步導致早期胚胎細胞第一次有絲分裂過程中卵裂球的不完全分離和Ⅱ型反向卵裂。

TUBB8基因外顯子編碼區測序結果發現以下變異位點

TUBB8基因突變相關疾病有2種遺傳方式：父系起源的常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳。為進一步探知TUBB8變異來源，應檢測女方的父母及兄弟姐妹的血樣，但因患者為獨生女，母親已去世，父親因身體等情況拒絕進行檢測，因此未行相關檢測，無法確定該基因型是新發的突變型還是遺傳所致。

雖然現已發現了數十種致病的TUBB8基因突變型，但目前還缺乏有效的治療方法。Jia等[10]的研究雖然提出正?；蛐蚑UBB8 cDNA胞內注射可以改善小鼠細胞紡錘體的組裝，并且注射后胚胎可以正常發育并產生活的后代，但小鼠早期胚胎分裂模式與人類不同，所以正?；蛐蚑UBB8 cDNA胞內注射在人體內應用的安全性和有效性方面還缺乏實驗論據支持。此外對生發泡置換、細胞質和紡錘體移植等進一步的研究可能會引發新的治療思路，但目前都尚不成熟。Ca2+可能參與早期胚胎細胞有絲分裂，Ca2+促進了紡錘體微管的破裂，并調節染色體向兩側紡錘體極點移動[13]，因此有研究提出補充Ca2+可能對TUBB8基因突變引發的胚胎發育停滯有正向治療作用的觀點[12]。

綜上所述，TUBB8基因在人類卵母細胞發育、受精和早期胚胎發育中發揮重要作用，基因突變會導致卵母細胞發育阻滯和早期胚胎發育停滯。本研究對有10年不孕史并反復IVF/ICSI助孕后早期胚胎發育停滯的患者進行了全外顯子基因檢測，發現了一種新的TUBB8基因突變型（c.208C>T/p.Pro70Ser）。該突變基因型導致胚胎發育停滯的具體作用機制還需進一步進行相關基礎研究探討。

志謝感謝復旦大學生命科學學院王磊教授和陳標榜老師的基因檢測工作。