宮頸癌DExH-box解旋酶9抑制轉錄本來源的長鏈非編碼RNA在高糖誘導的心肌細胞氧化應激損傷過程中的作用及其機制

馬 健 楊維維 李 帥 袁敏杰 魏 盟

全球范圍內,受糖尿病影響的成年人數量迅速增長，預計到2030年將達到近4億[1]?，F已證實，高血糖導致的心肌細胞氧化應激損傷是糖尿病心肌病變的重要原因和始動因素[2]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)誘導的氧化應激損傷在糖尿病心肌病變的發生、發展過程中起著關鍵作用[3-5]。高血糖能夠加重葡萄糖氧化和增加線粒體ROS的生成，導致心肌細胞DNA的損傷，加速細胞凋亡。

長鏈非編碼(lnc)RNA是一類轉錄長度超過200個核苷酸且不具編碼蛋白質功能的RNA分子，廣泛分布于細胞核與細胞質內。lncRNA廣泛參與腫瘤、心血管疾病、腎臟病在內的多種復雜性疾病的發生與發展。宮頸癌DExH-box解旋酶9(DHX9)抑制性轉錄物(cervical cancer DExH-box helicase 9 suppressive transcript，CCDST)來源的lncRNA(lnc-CCDST)在宮頸癌組織中顯著下調,lnc-CCDST負調控宮頸癌的細胞遷移、侵襲和血管生成，其在許多組織中均有表達，參與機體的正常發育、生理活動，以及多種疾病的發病過程[6-8]。lnc-CCDST參與心血管的細胞代謝過程[9]，而lnc-CCDST與糖尿病心肌病變的關系鮮見報道。本研究利用糖尿病小鼠模型和高糖誘導新生小鼠心肌細胞(neonatal mouse cardiomyocyte，NMC)模型探討lnc-CCDST對心肌細胞氧化應激損傷、細胞凋亡的影響。

微RNA(microRNA，miRNA)的長度約為22個核苷酸，通過與3’-非翻譯區(untranslated region,UTR)、5’-UTR和(或)靶信使RNA(mRNA)編碼區的互補位點堿基配對，在調控靶基因表達中發揮重要作用。根據最近提出的競爭性內源性RNA假說，多個lncRNA轉錄物可以通過其miRNA結合位點充當miRNA的內源性誘餌，調節彼此的生物活性?；诖?提出了lnc-CCDST是否也能以類似于蛋白質編碼基因的方式與miRNA相互作用的問題。通過在線數據庫預測及分析發現，miRNA-339-5p(miR-339-5p)可能負向調節lnc-CCDST的表達。因此，本研究進一步探討lnc-CCDST受miR-339-5p負向調節的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 取4～6周齡SPF級雄性Balb/C小鼠40只(體重為20～22 g)和出生1～2 d新生小鼠60只，均由上海西普爾-必凱實驗動物公司實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司； 杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)和抗生素購自美國Gibco 公司；45%葡萄糖液購自美國Sigma公司；小干擾RNA(siRNA)siCCDST-1、siCCDST-2和陰性對照scramble siRNA(si-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司(GenePharma)；miR-339-5p mimic和陰性對照購自美國Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立及實驗分組 將40只雄性小鼠以普通飼料適應性喂養1周，取其中20只小鼠建立糖尿病小鼠模型(模型組)。方法為麻醉后腹腔內注射1%STZ 50 mg/(kg·d)，連續5 d，最后一次注射STZ 72 h后測血糖，如血糖>15.0 mmol/L則確診為1型糖尿病。另20只小鼠用檸檬酸鹽緩沖液處理后作為對照組(血糖<12.0 mmol/L)。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測兩組小鼠心肌細胞的lnc-CCDST表達。

1.2.2 NMC細胞培養 60只新生小鼠制備NMC，制備方法：取新生小鼠心臟用膠原酶和蛋白酶消化10 min，小心分離收集心肌細胞，使用含5% FBS的最低基本培養基(MEM)于37 ℃、二氧化碳(CO2)體積分數為0.05條件下培養。NMC細胞分組處理如下：細胞接種于六孔板，正常糖組培養基為正常葡萄糖濃度的DMEM；高糖組培養基含35 mmol/L的D-葡萄糖。干預時間為24 h。每組至少重復3次。采用qRT-PCR檢測各組細胞的lnc-CCDST表達。

1.2.3 使用siRNA抑制lnc-CCDST表達 將設計好的siCCDST-1(5’-CTT GTG AAG TCT ATG AAT ATT-3’)、siCCDST-2(5’-AGC ACA ACC TTG GAG AAT AAA-3’)，以及si-NC通過TransMessenger轉染試劑盒(Qiagen)轉染NMC。轉染24 h后，采用qRT-PCR檢測NMC的lnc-CCDST表達。后續選擇si-NC和抑制效率高的siRNA抑制NMC lnc-CCDST表達，分別在正常糖和高糖條件下培養24 h，測定細胞內ROS含量、胱天蛋白酶-3(caspase-3)活性，以及DNA片段(DNA fragmentation)。ROS熒光探針(DCF-DA)檢測細胞內ROS的產生，通過熒光顯微鏡記錄DCF-DA信號(Invitrogen)；使用熒光測定試劑盒(Biomol Research Laboratories)測定細胞內caspase-3的活性；使用DNA fragmentation ELISA試劑盒檢測細胞DNA fragmentation (瑞士羅氏公司)，各檢測結果以其與正常糖培養條件下si-NC組的比值表示，每組至少重復3 次。

1.2.4 驗證lnc-CCDST的調控因子 經miRcode軟件預測miR-339-5p，miRNA-4637(miR-4637)和miRNA579-3p(miR-579-3p)可能是調控lnc-CCDST表達的miRNA。采用Trans Messenger試劑盒將合成的miR-339-5p、mimic、miR-4637 mimic及miR-579-3p mimic轉染NMC,過表達細胞miR-339-5p、miR-4637和miR-579-3p，使用錯義寡核苷酸(scrambled oligonucleotide)作為對照；選擇對lnc-CCDST有明顯抑制作用的miRNA，合成其化學修飾的反義寡核苷酸(antagomir，GenePharm)抑制該miRNA表達，仍使用scrambled oligonucleotide作為對照。利用TransMessenger轉染試劑盒進行轉染。采用qRT-PCR檢測各組lnc-CCDST的表達。每組至少重復3 次。

1.2.5 高糖刺激下過表達miR-339-5p對NMC的氧化應激損傷和細胞凋亡的影響 利用miR-339-5p mimic和scrambled oligonucleotide轉染NMC，再分別予正常糖和高糖刺激并檢測各組細胞內ROS含量、caspase-3活性，以及DNA fragmentation，結果以其與相應對照組的比值表示，每組至少重復3 次。

1.2.6 調節lnc-CCDST表達，分析miR-339-5p對心肌細胞氧化應激損傷的保護作用 將lnc-CCDST基因克隆至表達載體質粒pcDNA3.1(+)中，在高糖誘導處理的NMC中過表達lnc-CCDST。所有質粒均經測序證實，利用脂質體3000試劑(美國Invitrogen公司)進行質粒轉染。設立對照組、miR-339-5p過表達組、lnc-CCDST過表達組，以及miR-339-5p+lnc-CCDST共過表達組，檢測各組細胞內caspase-3活性和DNA fragmentation，結果以其與相應對照組的比值表示，每組至少重復3 次。

2 結 果

2.1 高糖對lnc-CCDST表達的影響 與正常小鼠比較，糖尿病模型小鼠心肌組織中lnc-CCDST表達顯著增加(1.14±0.67 比 5.22±3.48,P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組NMC中lnc-CCDST表達顯著增加(1.00±0.00比2.54±0.72，P<0.01)。

2.2 抑制lnc-CCDST表達對高糖誘導的NMC氧化應激損傷和細胞凋亡的影響 與si-NC比較，siCCDST-1、siCCDST-2均可顯著抑制NMC中lnc-CCDST表達(1.00±0.00比0.41±0.11、0.49±0.08，P值均<0.05)，siCCDST-1抑制效果更為顯著，故以下實驗使用siCCDST-1進行。與正常糖組相比，高糖組NMC內ROS含量和DNA fragmentation均顯著增加、caspase-3活性上升(P值均<0.05)，提示氧化應激相關的細胞凋亡顯著增多。而抑制lnc-CCDST能夠減少高糖誘導的NMC內ROS含量、降低caspase-3活性、抑制DNA fragmentation的增加(P值均<0.05)。見表1。

表1 抑制lnc-CCDST表達對高糖誘導的NMC氧化應激損傷和細胞凋亡的影響

2.3 miR-339-5p負向調節lnc-CCDST表達 應用DIANA-LncBase 和 miRcode軟件分析證實，miR-339-5p存在與lnc-CCDST的結合位點，見圖1。分別于NMC中過表達miR-339-5p、miR-4637和miR-579-3p，檢測發現過表達miR-339-5p抑制lnc-CCDST最為顯著，miR-339-5p組細胞lnc-CCDST的表達顯著低于對照組(0.45±0.09比1.00±0.00，P<0.05)；miR-4637和miR-579-3p組細胞lnc-CCDST的表達分別為0.68±0.32、0.93±0.27，與對照組的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。在此基礎上，進一步利用antagomir抑制miR-339-5p表達，lnc-CCDST的表達(1.83±0.43)隨之增加，與對照組間的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 miR-339-5p與lnc-CCDST的結合位點

2.4 miR-339-5p對高糖誘導引起的NMC氧化應激損傷及細胞凋亡的影響 過表達miR-339-5p能夠減少高糖誘導后心肌細胞內ROS含量、降低caspase-3活性、抑制DNA fragmentation的增加(P值均<0.05)。見表2。

表2 miR-339-5p對高糖誘導引起的NMC氧化應激損傷及細胞凋亡的影響

2.5 過表達lnc-CCDST抵消miR-339-5p對NMC氧化應激損傷的保護作用 過表達miR-339-5p后，高糖誘導的NMC中caspase-3活性顯著降低，DNA fragmentation顯著減少(P值均<0.05)；在此基礎上同時過表達lnc-CCDST可使miR-339-5p過表達組細胞內的caspase-3活性顯著升高，DNA fragmentation顯著增加(P值均<0.05)。見表3。

表3 過表達lnc-CCDST抵消miR-339-5p對NMC氧化應激損傷的保護作用

3 討 論

越來越多的證據表明，各種lncRNA通過調節miRNA的表達來發揮其生理、病理功能[10]。同時，miRNA又可進一步調節靶蛋白和lncRNA的表達。lncRNA與mRNA有許多共同特征：均具有復雜的剪接模式，通常由RNA聚合酶Ⅱ轉錄。lncRNA可能以類似于蛋白質編碼基因的方式被調節[11-12]。近年來，關于lncRNA在糖尿病及其并發癥中的作用研究引起了廣泛關注[13]，而lncRNA調節糖尿病心肌細胞氧化應激損傷的機制研究較為缺乏，故研究lnc-CCDST在糖尿病心肌組織中的表達，以及探討其與糖尿病心肌細胞氧化應激損傷的關系，將是預防和治療糖尿病心肌重構和心功能障礙的新的研究方向。

本研究結果顯示，無論離體或在體試驗，高糖干預后心肌細胞中lnc-CCDST表達均顯著增加，提示lnc-CCDST變化可能參與糖尿病心肌細胞氧化應激損傷過程。近年研究[14-15]發現，心肌細胞內ROS生成是糖尿病心肌損傷的重要機制，本研究同樣發現，高糖誘導后細胞內ROS生成和細胞凋亡明顯增加;而靶向性抑制lnc-CCDST后,心肌細胞中ROS生成、細胞凋亡得到顯著逆轉，證實 lnc-CCDST可能通過促進心肌細胞內ROS生成、細胞凋亡，進而參與糖尿病心肌細胞氧化應激損傷的過程。本研究結果進一步證明，miR-339-5p與lnc-CCDST之間具有明確的作用位點，且miR-339-5p負向調節心肌細胞中的lnc-CCDST表達；高糖環境下過表達miR-339-5p能夠靶向性抑制lnc-CCDST表達,進而減少心肌細胞內的ROS生成及細胞凋亡，最終發揮抗心肌細胞氧化應激損傷的作用，而這一保護作用在過表達lnc-CCDST后被明顯抵消。

新近研究明確提示,ROS生成在心肌重構過程中具有重要作用，抑制心肌細胞線粒體ROS生成可以顯著逆轉心肌重構。與其他課題組研究結論一致，本團隊的前期研究[16]結果亦證實,給予靶向性抗氧化劑mito-TEMPO可以有效減少心肌細胞ROS生成并改善糖尿病心肌重構。在此基礎上進一步證實上調F0F1-ATP合酶表達及其活性能夠減少心肌細胞線粒體ROS生成，并最終改善糖尿病小鼠心肌損傷[17]。而miR-339-5p/lnc-CCDST通路是否直接調節ATP合酶表達，進而影響心肌細胞ROS生成尚不明確，因此也為下一步的研究提供了前提和方向。

本研究證實，miR-339-5p/lnc-CCDST通路參與了高糖誘導的心肌細胞氧化應激損傷及細胞凋亡的過程，其機制與調節心肌細胞ROS生成、caspase-3活性及DNA損傷有關，提示miR-339-5p/lnc-CCDST通路能夠影響糖尿病心肌細胞氧化應激損傷及心肌重構。本研究結果將為進一步探索糖尿病心肌病及心臟功能障礙的防治提供理論依據和基礎，從心肌細胞代謝角度為糖尿病心肌病變的臨床治療提供新的靶點和方向。