紅毛藻多糖對H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷的保護作用

何萍萍，鄭雅君，鄭明靜,2,3,4，姜澤東,2,3,4,*，杜希萍,2,3,4，朱艷冰,2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4,*

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門南方海洋研究中心，經濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

紅毛藻（Bangia fusco-purpurea）又稱為紅毛菜，是我國東南沿海特色的食用海藻資源。紅毛藻在福建、廣東沿海分布較廣，“莆田紅毛菜”是國家地理標志的名優海藻。紅毛藻富含蛋白質、多糖、氨基酸、游離脂肪酸和維生素，有較高的營養價值，在我國及東南亞地區具有悠久的食用歷史[1-3]。多糖是紅毛藻中主要的膳食營養活性成分之一。研究報道紅毛藻多糖（Bangia fusco-purpureapolysaccharide，BFP）主要由半乳糖（66.55%，質量分數，后同）和硫酸基團（10.34%）以及少量的糖醛酸（7.27%）、甘露糖（6.04%）和葡萄糖（5.92%）等組成，其平均分子質量約133.18 kDa[1]。BFP具有抑制血管緊張素轉化酶[4]、免疫誘導[5]、抑菌[5]、抑制α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶[1]等多種有益的生物活性，在食品、生物醫藥以及化妝品領域具有潛在的開發應用價值。此外，研究證明，BFP對·OH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基以及脂質過氧化體有清除作用，具有體外抗氧化活性[6]。本課題組近期研究表明，BFP表現出優良的抵抗人皮膚成纖維細胞光氧化損傷的能力[7]。隨著人們對食品安全和飲食健康的日益關注，天然抗氧化劑的研究和開發日益受到重視。目前，關于BFP的抗氧化損傷相關機理還鮮見報道。因此，BFP作為高效安全的天然抗氧化劑具有廣闊的研究和開發應用前景。

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，細胞內會大量產生和積累活性氧（reactive oxygen species，ROS）[8]。ROS的過量產生和累積會破壞胞內生物分子，如脂質過氧化、蛋白質氧化和DNA損傷等，從而引起機體產生炎癥、癌癥、神經變性等病理變化[9-11]。腸上皮在吸收營養方面極為重要，也是機體與外部環境之間的物理屏障[12]。人類炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的發病機理與ROS引起的腸上皮細胞氧化損傷密切相關[11]。潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是IBD的一種主要形式，在許多國家發病率和患病率都很高。UC患者通常會出現嘔吐、厭食、緊急腹瀉和直腸出血等癥狀[13]。目前，盡管尚未完全了解UC的發病機制，越來越多的實驗和臨床研究證據表明氧化應激在結腸炎的發展中起著至關重要的作用[14-15]。在結腸炎發展過程中，彌漫性炎癥細胞浸潤和小腸黏膜隱窩膿腫會誘導ROS的大量產生，從而引起氧化應激損傷結腸細胞和影響腸上皮屏障的通透性，導致病原體侵襲、炎癥細胞浸潤和炎癥的過度損壞[16]。另外，過量生成的ROS會降低內源性抗氧化酶的活性，包括過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），并消耗受損細胞中的非酶類抗氧化物谷胱甘肽（glutathione，GSH）[17]。許多研究者提出可以通過抗氧化劑和ROS靶向治療來預防或減輕結腸炎癥[15,18-19]。因此，篩選和研究能夠有效調控氧化應激引起結腸細胞損傷的抗氧化劑，是預防和輔助治療結腸炎、改善患者生活質量的有效策略之一。

綜上，可推測BFP可能對腸上皮細胞的氧化應激損傷同樣具有保護作用，其或許有助于預防和緩解由氧化應激損傷引起的腸道疾病。人結腸腺癌Caco-2細胞是用于研究腸道屏障損傷發生與修復機制的經典體外細胞模型，當細胞長滿時表現出特征性的腸上皮細胞分化現象，并具有與腸上皮細胞相似的代謝酶系和分泌功能[20]。H2O2是體內氧化代謝的中間產物，會引起細胞氧化應激損傷[21]。因此，本研究采用H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷模型，探討BFP對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用以及由氧化應激誘導細胞凋亡的抑制作用，旨在闡明紅毛藻的食藥用功效機理，為紅毛藻作為精準營養食品的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結腸腺癌細胞（Caco-2） 美國模式培養物集存庫；高糖Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培養基 美國Hyclone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、H2O2美國西格瑪奧德里奇有限公司；RIPA裂解液 北京索萊寶科技有限公司；SOD、CAT、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成科技有限公司；Hoechst 33258熒光染色試劑盒、ROS檢測試劑盒、Caspase 3和Caspase 9活力檢測試劑盒上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HERAcell VIOS 160i CO2細胞培養箱 美國賽默飛世爾科技公司；Avanti J26XP高速冷凍離心機 德國貝克曼公司；Cytation? 5細胞成像多模式檢測儀 美國伯騰儀器有限公司；TS100倒置生物顯微鏡、50i熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 BFP的提取和純化

BFP的提取和純化參考文獻[1]并稍作修改。紅毛藻粗多糖經Sevag法[22]脫除蛋白質后，利用丙烯葡聚糖凝交S-400 HR柱層析（1.6 cm×100 cm）純化[23]，采用0.1 mol/L NaCl進行洗脫，利用自動樣品收集器按4 mL/管進行收集，并用苯酚-硫酸法于490 nm波長處測定吸光度以進行跟蹤檢測，以洗脫體積為橫坐標，490 nm波長處吸光度為縱坐標作圖，繪制洗脫曲線。收集洗脫峰處多糖溶液，經3 500 Da透析膜透析后得到BFP溶液，冷凍干燥得到BFP。

1.3.2 BFP的Caco-2細胞毒性分析

采用MTT法[24]測定BFP干預后Caco-2細胞活力。細胞于高糖DMEM生長培養基（含體積分數10%胎牛血清、100 IU/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素）中進行常規及傳代培養。將處于對數生長期的Caco-2細胞以3×104個/孔的濃度接種于96 孔細胞培養板中，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育24 h。細胞長滿單層后，用不同質量濃度的BFP生長培養基（0、31.25、62.50、125、250、500、1 000 μg/mL）處理細胞。經過24 h孵育，除去上清液，每孔加入50 μL的含質量分數5% MTT的培養基，繼續孵育30 min。移去上清液后，每孔用pH 7.4 0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗2 次，加入100 μL的二甲基亞砜，振蕩20 min，甲瓚完全溶解后，于CytationTM5細胞成像多模式檢測儀測定570 nm波長處光密度值（OD570nm），并根據公式（1）計算細胞活力。以細胞活力大于等于90%為標準，確定BFP的安全劑量。

式中：ODT、ODC和ODB分別是實驗組、對照組和空白組在570 nm波長處的光密度值。對照組用不含BFP的DMEM生長培養基處理，實驗組用含有不同質量濃度BFP的DMEM生長培養基處理，空白組為DMEM生長培養基。

1.3.3 H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型建立

采用An Jun等[25]報道的方法建立H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型。實驗分組包括對照組和H2O2氧化損傷模型組。將處于對數生長期的Caco-2細胞以3×104個/孔接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養24 h。細胞長滿單層后，移除生長培養基。對照組細胞中加入100 μL DMEM生長培養基；H2O2氧化損傷模型組細胞中每孔加入100 μL不同濃度H2O2的DMEM生長培養基（H2O2終濃度分別為100、200、400、800、1 200、1 600、2 000 μmol/L）。處理后的細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養4 h，采用1.3.2節方法檢測細胞活力。

1.3.4 H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞經BFP干預后細胞活力的測定

參照Liang Rong等[26]報道的方法分析BFP對H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷的保護作用。實驗分組包括空白組、對照組、H2O2誘導氧化損傷組和BFP干預保護組?？瞻捉M每孔加入100 μL DMEM生長培養基，其余組別每孔加入100 μL處于對數生長期Caco-2細胞懸液（3×104個/孔），于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養24 h。細胞長滿單層后，移除生長培養基?？瞻捉M、對照組和H2O2誘導氧化損傷組每孔加入100 μL DMEM生長培養基，BFP干預保護組加入100 μL含BFP（終質量濃度分別為100、200、500 μg/mL）的DMEM生長培養基，繼續孵育24 h。孵育結束后，H2O2誘導氧化損傷組和BFP干預保護組每孔加入含H2O2（終濃度為800 μmol/L）的DMEM生長培養基，空白組和對照組加入等體積的DMEM生長培養基，繼續孵育4 h，采用1.3.2節MTT法檢測細胞活力。

1.3.5 H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞經BFP干預后細胞形態的觀察

采用1.3.2節中的方法將處于對數生長期Caco-2細胞接種到96 孔板，按1.3.3節方法處理細胞后，使用50i熒光顯微鏡（放大倍數400）對細胞進行形態學觀察，并分別拍攝空白組、對照組、H2O2誘導氧化損傷組和BFP干預保護組中的Caco-2細胞的形態，比較各組之間細胞形態的差異[27]。

1.3.6 H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞經BFP干預后細胞內ROS含量的測定

利用二氯熒光乙酰乙酸鹽熒光探針測定Caco-2細胞內產生的ROS含量[28]。將Caco-2細胞接種到96 孔黑色聚苯乙烯微孔板，按1.3.3節誘導細胞氧化損傷的方法處理細胞后，按照ROS檢測試劑盒說明書操作步驟測定各孔的熒光強度，根據公式（2）計算ROS相對含量。

1.3.7 H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞經BFP干預后細胞中SOD活力、CAT活力、GSH含量和MDA含量的測定

采用1.3.2節方法，將Caco-2細胞接種到6 孔板，按1.3.3節的方法誘導細胞氧化損傷后，收集并裂解細胞，離心取上清液。按照相應的試劑盒說明書操作步驟測定細胞SOD、CAT活力和GSH、MDA含量。

1.3.8 H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞經BFP干預后細胞凋亡及細胞內Caspase-3和Caspase-9活力測定

采用Hoechst 33258染色法檢測H2O2誘導的Caco-2細胞凋亡[29]。Caco-2細胞接種到細胞培養皿，待細胞長滿單層后，按1.3.3節方法處理各組細胞。按照相應的試劑盒說明書采集圖像并測定酶活力。

1.4 數據統計與分析

為了確保實驗數據的可信度，進行3 次獨立實驗，每組實驗重復3 次，實驗結果表示為平均值±標準偏差。利用SPSS 17.0軟件，使用單因素方差中的Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05、P＜0.01分別表示差異顯著、極顯著。

2 結果與分析

2.1 BFP對Caco-2細胞活力的影響

采用MTT法分析BFP對Caco-2細胞活力的影響，結果如圖1所示。在BFP質量濃度為0～1 000 μg/mL范圍內，細胞活力均大于90%，與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。實驗結果表明，BFP在測試質量濃度（0～1 000 μg/mL）范圍內對Caco-2細胞沒有顯著毒性作用，所以本研究選取100、200、500 μg/mL作為BFP對H2O2誘導氧化損傷的干預劑量進行后續研究。

圖1 BFP對Caco-2細胞活力的影響Fig.1 Effect of BFP at different concentrations on the viability of Caco-2 cells

2.2 BFP對H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷的影響

H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷模型建立的結果如圖2所示。在不同濃度的H2O2處理Caco-2細胞4 h后，與對照組相比，100 μmol/L的H2O2對Caco-2細胞活力無顯著影響，隨著培養基中H2O2濃度的升高，Caco-2細胞活力顯著下降，表明在測試條件下，培養基中H2O2濃度在200～2 000 μmol/L范圍內可有效誘導Caco-2細胞氧化損傷，并且存在濃度依賴性。當培養基中H2O2濃度為800 μmol/L時，Caco-2細胞活力抑制率接近50%。因此，后續選取培養基中H2O2濃度為800 μmol/L作用細胞4 h為建立Caco-2細胞氧化損傷的誘導條件。

圖2 不同濃度的H2O2對Caco-2細胞活力的影響Fig.2 Effect of H2O2 at different concentrations on the viability of Caco-2 cells

BFP對H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷的保護作用結果如圖3所示。與對照組相比，H2O2誘導氧化損傷組中Caco-2細胞活力顯著降低，為（51.3±4.1）%；經不同質量濃度的BFP（100、200、500 μg/mL）處理的BFP干預保護組中Caco-2細胞活力隨著多糖質量濃度增加顯著升高，分別達到（77.4±2.2）%、（83.3±2.8）%和（90.9±2.1）%，與H2O2誘導氧化損傷組相比，分別提高了50.9%、62.4%和77.2%。以上結果表明，BFP預處理能有效緩解H2O2誘導的Caco-2細胞氧化應激損傷，并且在測定的質量濃度（0～500 μg/mL）范圍內呈劑量效應關系，提示BFP對H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷具有保護作用。

圖3 BFP對H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷的保護作用Fig.3 Protective effect of BFP at different concentrations on H2O2-induced oxidative damage in Caco-2 cells

2.3 BFP對H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞形態的影響

H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷的細胞形態觀察結果如圖4所示。結果顯示，對照組中Caco-2細胞貼壁生長，細胞密度大，細胞間銜接緊密，生長狀態良好（圖4A）；H2O2誘導氧化損傷組中Caco-2細胞數量明顯減少，貼壁性變差，出現明顯皺縮或膨大，生長狀態較差（圖4B）；與H2O2誘導氧化損傷組中的細胞相比，經BFP預處理后的細胞，其形態隨著多糖質量濃度的增加得到顯著改善，細胞密度顯著增大，細胞間銜接增加，生長狀態趨于正常（圖4C～E）。以上結果表明，BFP能有效改善H2O2誘導氧化應激損傷的Caco-2細胞形態。

圖4 H2O2誘導Caco-2細胞氧化損傷的細胞形態學觀察（×400）Fig.4 Morphological observation of H2O2-induced oxidative damage in Caco-2 cells (× 400)

2.4 BFP對H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞內ROS含量的影響

ROS引起的腸上皮細胞氧化損傷與IBD的發病機理息息相關[11]。2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯自身無熒光，可穿過細胞膜進入細胞內進而被胞內的酯酶水解，經細胞內的ROS氧化轉化為具有強熒光的2’,7’-二氯熒光素（無法穿過細胞膜）。因此，通過檢測二氯熒光素的熒光強度可反映出細胞內ROS的水平[30-31]。Caco-2細胞內ROS含量測定結果如圖5所示。H2O2處理能顯著誘導Caco-2細胞內ROS水平的升高（P＜0.05），而經不同質量濃度BFP（100、200、500 μg/mL）干預后，細胞內ROS生成水平被顯著抑制，并隨多糖質量濃度升高呈下降趨勢。當BFP質量濃度為500 μg/mL時，H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞內ROS水平達到最低。以上結果表明，BFP能有效降低H2O2誘導的Caco-2細胞內ROS水平。ROS是細胞氧化損傷的一種重要的標志因子，BFP干預能夠顯著降低H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞內ROS水平，從而緩解氧化損傷，保護細胞[32]。

圖5 BFP對H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞內相對ROS水平的影響Fig.5 Effect of BFP at different concentrations on ROS levels in Caco-2 cells induced by H2O2

2.5 BFP對Caco-2細胞內SOD活力、CAT活力、GSH含量和MDA含量的影響

BFP對H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞內SOD活力、CAT活力、GSH水平和MDA含量的影響如表1所示。與對照組相比，H2O2誘導氧化損傷組中Caco-2細胞內SOD活力、CAT活力和GSH含量顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與H2O2誘導氧化損傷組相比，BFP干預保護組中Caco-2細胞內的SOD活力、CAT活力和GSH含量總體顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量極顯著降低（P＜0.01），并呈現出較好的多糖質量濃度依賴性。研究報道，SOD和CAT是細胞內重要的抗氧化酶，是細胞防御氧化應激的重要組成部分，能有效清除ROS，陰止脂質過氧化，提升機體的抗氧化能力[33-35]。GSH是一種重要的非酶類抗氧化物，具有清除自由基、解毒等多種生理功能。GSH水平是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[36]。MDA是脂質過氧化作用的最終分解產物，其含量是反映脂質過氧化物和ROS水平的重要指標[37]。ROS的過量產生和積累致使細胞膜脂質過氧化，產生脂質過氧化產物MDA，最終引起細胞的氧化損傷或凋亡，所以MDA的含量也可間接反映出細胞氧化應激損傷的程度[32,37]。以上實驗結果表明，BFP能顯著提高H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞內SOD和CAT活力以及GSH水平，有效清除氧化損傷細胞內的ROS，陰止脂質的過氧化，顯著降低MDA含量，從而保護Caco-2細胞免受H2O2誘導的氧化損傷。這和上述BFP能通過顯著降低H2O2誘導氧化損傷細胞內ROS水平來緩解細胞氧化損傷的結果相一致。

表1 BFP對H2O2誘導氧化損傷Caco-2細胞內SOD活力、CAT活力、GSH含量和MDA含量的影響（n＝6）Table 1 Effect of BFP at different concentrations on SOD activity, CAT activity, GSH level and MDA content in Caco-2 cells induced by H2O2 (n = 6)

2.6 BFP對H2O2誘導Caco-2細胞凋亡的影響

細胞內ROS含量的增加和/或抗氧化劑含量的減少、氧化還原穩態破壞以及脂質、蛋白質、DNA等生物大分子的不可逆氧化修飾等氧化應激均會導致細胞凋亡信號產生[38]。凋亡又稱程序性細胞死亡，是機體正常細胞更新、免疫系統的正常發育、激素依賴性細胞萎縮、胚胎發育和化學誘導的細胞死亡等過程的重要組成部分，但不適當的細胞凋亡（太少或太多）是誘發多種疾?。ㄈ缟窠浲诵行约膊?、缺血性損傷、自身免疫性疾病和多種類型的癌癥等）的重要因素之一[39]。BFP對H2O2誘導Caco-2細胞凋亡調控作用的結果如圖6所示。對照組中，正常生長的Caco-2細胞的細胞核呈現出彌散均勻的低強度藍色熒光，表明Caco-2細胞沒有發生顯著的凋亡現象（圖6A）；H2O2誘導氧化損傷組中，Caco-2細胞的細胞核呈現固縮致密高度染色的高強度藍色熒光，表明Caco-2細胞發生顯著的凋亡現象（圖6B）；H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞經不同質量濃度的BFP干預保護后，細胞核染色的熒光強度呈現出顯著的多糖質量濃度依賴性變化，熒光強度隨著多糖質量濃度升高逐漸降低（圖6C～E），高質量濃度多糖干預的氧化損傷細胞核的熒光強度明顯減弱，細胞核呈現出彌散均勻的低強度藍色熒光狀態（圖6E）。以上實驗結果表明，BFP能夠有效抑制H2O2誘導Caco-2細胞的細胞凋亡，緩解細胞的氧化損傷。

圖6 BFP對H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of BFP at different concentrations on apoptosis in Caco-2 cells induced by H2O2

2.7 BFP對H2O2誘導Caco-2細胞內Caspase-3和Caspase-9活力的影響

Caspases是富含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶，Caspase家族信號通路在細胞凋亡的發生過程中起著至關重要的作用[40-41]。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵蛋白酶，其活化與細胞DNA斷裂和細胞凋亡的形成聯系極為密切[42]。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的上游分子，Caspase-9的激活與ROS有密切關系[43]。因此，本實驗分析了BFP對H2O2誘導Caco-2細胞內Caspase-3和Caspase-9活力的影響。如圖7所示，與對照組相比，H2O2誘導氧化損傷組中的Caco-2細胞內Caspase-3和Caspase-9活力顯著升高；經不同質量濃度的BFP干預保護后，H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞內Caspase-3和Caspase-9活力隨多糖質量濃度增加顯著下降，表明BFP能夠有效抑制H2O2氧化損傷引起的細胞凋亡，進而保護Caco-2細胞。這和上述BFP能夠有效緩解H2O2誘導Caco-2細胞凋亡的結果相符合。

圖7 BFP對H2O2誘導氧化損傷的Caco-2細胞Caspase-3（A）、Caspase-9（B）活力的影響Fig.7 Effect of BFP at different concentrations on the activities of caspase-3 (A) and caspase-9 (B) in Caco-2 cells induced by H2O2

3 討 論

氧化應激是常見的應激損傷，內源性和/或外源性不良刺激會打破氧化系統和抗氧化系統相對平衡的狀態，使機體處于氧化應激狀態[44]。氧化應激主要表現為細胞內產生過量的ROS，導致細胞損傷和凋亡等[9]。胃腸道是體內ROS與膳食抗氧化劑相互作用的重要部位，ROS的過量產生會引起腸上皮細胞的損傷[45-46]。因此，人體的抗氧化系統需要外源抗氧化劑來有效地避免氧化應激的發生。近年來，多糖作為天然抗氧化劑的研究與開發利用已經引起了廣泛的關注。王群[47]建立了Caco-2細胞模擬腸道屏障模型，證明了螺旋藻多糖能預防H2O2誘導的Caco-2細胞的氧化損傷；王明星等[48]發現猴頭菌多糖能顯著降低H2O2誘導的Caco-2細胞凋亡，降低細胞中MDA的含量，提高SOD活力及乳酸脫氫酶含量，提示猴頭菌多糖的抗UC活性與其減少細胞的氧化應激相關；何傳波等[49]發現仙草多糖可增加細胞內抗氧化酶活性，減少脂質過氧化物生成，有明顯的氧化損傷保護作用。這些研究表明，天然膳食多糖可作為潛在的機體外源抗氧化劑有效抵抗氧化應激引起的細胞損傷。

本實驗利用H2O2建立Caco-2氧化損傷模型，分析了BFP對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用。實驗結果表明，BFP在實驗質量濃度（0～1 000 μg/mL）范圍內對Caco-2細胞的細胞活力無顯著影響。經800 μmol/L H2O2處理Caco-2細胞模型4 h之后，Caco-2細胞內ROS水平與對照組（未經H2O2處理）相比顯著升高，引起細胞氧化應激損傷[21]。與此同時，氧化損傷組中Caco-2細胞的抗氧化酶（SOD和CAT）活力和非酶類抗氧化物GSH水平與對照組相比顯著下降，MDA含量則顯著升高，表明在H2O2誘導下，Caco-2細胞內產生大量超氧化物自由基，過量的自由基可能會抑制抗氧化酶活性，導致氧化損傷細胞內的SOD、CAT和GSH水平與對照組相比顯著下降，自由基的清除能力減弱，進一步加重細胞氧化損傷程度[35]。另一方面，過量的自由基使細胞內的多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，產生MDA等代謝產物，進而導致細胞膜的通透性增加[37]。此外，細胞內Caspase-3和Caspase-9活力顯著升高，加速了細胞凋亡。然而，在加入BFP進行保護后，BFP能夠顯著抑制H2O2誘導氧化應激損傷Caco-2細胞模型內ROS的生成，有效清除ROS，顯著提高SOD、CAT活力和GSH的水平，并顯著降低細胞內MDA的產生量，陰止脂質的過氧化。同時，BFP能夠顯著下調H2O2誘導氧化應激損傷的Caco-2細胞模型內Caspase-3和Caspase-9活力，緩解氧化應激損傷引起的細胞凋亡，使細胞維持正常形態，保護Caco-2細胞免受氧化損傷。

綜上所述，BFP可有效緩解H2O2誘導的Caco-2細胞氧化應激損傷，具有潛在預防由氧化應激引起的腸道炎癥的應用價值。本研究結果可豐富紅毛藻的食品營養學理論基礎，為其開發預防腸道炎癥的精準營養食品提供科學依據。