超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定飼料中的喹諾酮類和四環素類藥物含量

黃志偉，李洪波，劉利曉，趙盼盼，馮 晉

駐馬店市獸藥飼料（動物產品）質量檢驗監測中心，河南駐馬店463000

喹諾酮類又稱吡啶酮酸類或吡酮酸類，其化合物結構中含有4-喹諾酮環，是人工合成的抗菌藥。因其抗菌譜廣，價格低，在畜禽養殖中被廣泛使用（王金秋等，2014）。喹諾酮類藥物的長期濫用會導致在畜禽動物體內蓄積，進而通過食物鏈影響人類健康（Hoelzer 等，2017；Marshall 等，2011；王志杰等，2010）。四環素類抗生素（TCs），其化學結構屬氫化并四苯環衍生物，由放線菌產生（粟慧等，2018），被廣泛用于多種細菌及立克次氏體、支原體、衣原體感染的治療，同時也會引起很多不良反應，如消化道反應，肝、腎損害，影響牙齒和骨骼的發育等（鐘偉龍等，2012）?；陲暳现蟹欠ㄌ砑游锖涂股氐闹卮笪：?，歐盟從2006 年起就禁止在動物飼料中添加抗生素類藥物（王湘如等，2019；顧欣等，2013）；我國農業農村部也禁止促生長類抗生素在動物飼料中的使用。因此為保證動物飼料安全，進而保障畜禽產品質量安全，有必要建立飼料中抗菌藥物多通量同步聯合檢測檢驗方法。目前，關于喹諾酮類和四環素類的液相色譜串聯質譜檢測法都有報道（陶婭等，2017；封家旺等，2015；郝向洪等，2015），但同時檢測喹諾酮類和四環素類的高效液相串聯質譜檢測分析法鮮見報道。本實驗旨在建立同時檢測喹諾酮類和四環素類的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法，為快速篩查、檢驗檢測飼料中喹諾酮類和四環素類藥物的違規使用和非法添加情況提供技術保障。

1 材料和方法

1.1 儀器 Acquit UPLC-Xevo TQ-S 質譜聯用儀（Waters 公司）；TTL-DCⅡ氮吹儀（北京同泰科技發展有限公司）；3-30k 臺式高速冷凍離心機（Sigma 公司）；AG125 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；IKAMS3.Basic 圓周振蕩器（廣州儀科實驗室技術有限公司）；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；Waters Oasis HLB 固相萃取柱（3 CC/60 mg）。

1.2 試劑 乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉均為分析純，實驗用水為經mili-Q 凈化系統制備的去離子水；恩諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星購于Dr.Ehrenstorfer.GmbH；土霉素購于中國獸醫藥品監察所；鹽酸四環素和鹽酸金霉素購于中國藥品生物制品檢定所；多西環素購于中國食品藥品檢定研究院。

Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液的制備：分別稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 mL 溶解，用1 mol/L 氫氧化鈉溶解調節pH 至（4.0±0.5），加水稀釋至1000 mL，即得。1%甲酸甲醇的制備：取甲酸1.0 mL，加入甲醇99.0 mL，充分搖勻，即得。

1.3 標準儲備液的配制 分別稱取適量的恩諾沙星、環丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、土霉素、金霉素、四環素和多西環素對照品，用甲醇溶解并稀釋成約1.0 mg/mL 的標準儲備液；并于-20 ℃下避光保存。該標準儲備液在使用時，先恢復至室溫，然后稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取 稱取飼料試樣2 g（精確到0.01 g），置于50 mL 離心管內，加1%甲酸甲醇10 mL，渦旋混勻1 min，振蕩提取10 min，超聲10 min，6000 r/min 離心5 min，轉移上清液于另一50 mL 離心管內。1%甲酸甲醇10 mL 重復提取一次，合并提取液，渦旋混勻1 min。準確量取提取液1 mL 于10 mL 離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液5 mL，渦旋30 s，加水10 mL 混勻后，作為待凈化溶液。

1.4.2 樣品凈化 HLB 固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3 mL 水活化。待凈化溶液全部過柱，依次用3 mL 水和5 mL 5%甲醇淋洗，擠干。用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，50 ℃氮氣吹干，準確加入2 mL 20%乙腈溶解殘渣，過0.22 μm 濾膜后供超液相色譜-串聯質譜檢測。

1.5 實驗方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.5.2 質譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監測MRM；離子源溫度：150 ℃；霧化溫度：500 ℃；霧化器流速：1000 L/Hr；錐孔氣流速：150 L/Hr；毛細管電壓：1.2 kv；定性、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 喹諾酮類和四環素類定性、定量離子及對應的錐孔電壓和碰撞能量

2 結果

2.1 線性關系 精密吸取100 μg/L 的標準混合中間液0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mL 于1.5 mL 離心管中，分別加入0.5 mL 空白凈化液，分別加入20%乙腈水溶液0.475、0.45、0.4、0.3、0.0 mL，渦旋混勻，配制成2.5、5、10、20、50 μg/L 的系列標準溶液，并依次上機，以各化合物的質量濃度為橫坐標，定量離子的質量色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（表3），可以看出9 種化合物在2.5～50 μg/L 內呈現出良好的線性關系，相關系數均在0.995 以上。

表3 喹諾酮類和四環素類的保留時間、線性方程及相關系數

2.2 檢測限和定量限 向空白飼料試樣中添加適量的混合標準溶液，經處理上機。根據特征質量色譜峰的信噪比S/N＞3 為檢測限，S/N＞10 為定量限，檢測到喹諾酮類藥物、四環素類藥物的檢測限為0.025 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。

2.3 方法的靈敏度和準確度 在空白飼料中添加混合標準工作液，制備成含量為0.05、0.1、0.25 mg/kg 三種濃度水平的標準添加試樣，每個濃度做5 個平行，連續做3 批，其平均回收率、批內（批間）變異系數如表4。喹諾酮類和四環素類的回收率為74.7%～93.2%，批內、批間的相對偏差均小于15%。喹諾酮類空白飼料添加色譜圖見圖1，四環素類空白飼料添加色譜圖見圖2。

圖1 空白飼料中添加0.1 mg/kg 的喹諾酮類藥物特征離子質量色譜圖

表4 飼料中喹諾酮類和四環素類的回收率及RSD（n=5）

3 討論與小結

3.1 色譜條件的優化 喹諾酮類和四環素類均具有兩性基團，屬于酸堿兩性化合物，在水溶液中以離子形式存在，通常選用酸性溶液作為流動相組成成分（彭麗等，2014；錢卓真等2010）。在使用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm 粒徑1.7 μm）作為色譜柱條件下，分別嘗試了甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、水多種配比流動相條件，結果發現用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相能獲得較好的峰型和較高的響應。

3.2 質譜條件的優化 首先分別將喹諾酮類和四環素類（100 ng/mL）標準溶液流動注射進樣，以正離子模式進行一級質譜圖掃描，發現這些藥物的［M+H］+峰均比較強，故選擇［M+H］+作為母離子。然后進行子離子掃描，最終分別選擇響應值較高的兩個子離子作為定性和定量離子，并優化錐孔電壓和碰撞能量等質譜參數，使其相應的響應值達到最大。

3.3 樣品前處理條件的優化 由于飼料樣品中基質成分比較復雜，蛋白質、脂類和無機鹽類含量高，利用目標化合物中堿性基團，采用酸化有機提取溶液提取。經過多次實驗最終確定用1%甲酸甲醇溶液作為提取液回收率最好。為減少基質干擾，降低基質效應的影響，需對提取樣品進一步凈化。本實驗分別考察了MCX、C18 和HLB 固相萃取柱的凈化效果，結果發現HLB 固相萃取柱回收率較高，批內變異系數相對較小，最終選擇HLB固相萃取柱作為凈化柱。同時對淋洗條件進行了優化，結果發現單獨使用水淋洗都有較大的基質干擾，采用10%甲醇淋洗，標準溶液添加回收率明顯降低；因此采用依次用水和5%甲醇淋洗，并且增加5%甲醇淋洗量為5 mL，甲醇洗脫，最終得到了滿意的實驗結果。

不同種類的飼料組成成分差異較大，最終產生的基質效應的大小也不同，本研究采用空白飼料做添加回收實驗，同時用該空白飼料的基質工作液校正，能得到滿意結果；但不同種類空白飼料偏差較大。尤其是四環素類藥物，受金屬離子的干擾較大，因此本方法不適合礦物質預混合飼料的檢測。本研究將5 種喹諾酮類藥物和4 種四環素類藥物作為目標化合物進行實驗探索，同時優化樣品前處理條件、色譜條件和質譜條件，建立了飼料中同時檢測喹諾酮類和四環素類的UPLC-MS/MS 方法，并且其準確度和靈敏度能滿足飼料檢測的需要。