琯溪蜜柚柚皮苷純化鑒定及其對胰脂肪酶的抑制作用

晏 幸，肖文熙，歐麗明，上官宇晨，杜希萍,3,4，李利君,3,4，胡 陽,3,4，倪 輝,3,4,*

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.集美大學港口與海岸工程學院，福建 廈門 361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

肥胖是一種影響人們健康的全球性慢性代謝性疾病[1]；會誘發心血管疾病、糖尿病、高血壓、代謝綜合征等慢性代謝性疾病[2]。胰脂肪酶（EC 3.1.1.3）是人體脂質消化的關鍵酶，抑制其活性可以有效地減少脂質吸收，從而預防及降低肥胖癥狀[3]。奧利司他等一些胰脂肪酶抑制劑已經被開發出來，但其會引起嚴重的胃腸道副作用[4]。

水果含有豐富的胰脂肪酶抑制劑，且具有毒性低、結構多樣等特點[5-6]。其中，黃酮是水果中主要活性成分[7]。從石榴、草莓、葡萄等水果中提取到的多種黃酮物質顯示出對胰脂肪酶良好的抑制作用[8-11]，這些結果說明水果黃酮是胰脂肪酶抑制劑的來源。

琯溪蜜柚是一種特色大宗的柑橘類水果，僅福建省平和縣年產量就超過170萬 t[12]?，g溪蜜柚含有豐富的黃酮物質[13]，但是其黃酮抑制胰脂肪酶的研究尚不夠深入。本實驗以琯溪蜜柚柚皮為原料，利用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱分離純化柚皮黃酮；利用液相色譜-質譜聯用儀及紅外光譜技術對分離純化組分進行鑒定分析；通過酶抑制動力學和分子對接技術探究純化組分對胰脂肪酶的抑制特征，為利用琯溪蜜柚黃酮開發新型安全的胰脂肪酶抑制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

琯溪蜜柚購于福建省漳州市平和縣。

無水乙醇（分析純） 上海沃凱生物技術有限公司；柚皮苷 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、胰脂肪酶（來源于豬胰腺，30 units/mg）、奧利司他、4-硝基苯基丁酸脂 美國Sigma公司；對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）、三羥甲基氨基甲烷、3-嗎啉丙磺酸、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、無水氯化鈣 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JP-500C型高速粉碎機 永康市久品工貿有限公司；KQ5200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；常壓層析柱（16 nm×60 nm）、BT1-100E型恒流泵上海琪特分析儀器有限公司；SBS-100N自動部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-8000紫外分光光度計上海元析儀器有限公司；UliMate 3000高效液相色譜儀、TQU04549質譜儀、NICOLET IS50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀美國賽默飛世爾科技有限公司；Epoch 2T型酶標儀美國伯騰儀器有限公司產品；QL-901振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 琯溪蜜柚黃酮的分離純化

將新鮮柚皮清洗干凈后，剪成1 cm2的小塊，曬干至恒質量，粉碎，過60目篩制成柚皮粉。精確稱取1.00 g柚皮粉，以70%乙醇（體積分數，下同）為提取溶劑，在液料比30∶1、超聲溫度30 ℃、超聲功率200 W的條件下超聲提取50 min，趁熱過濾，經真空減壓濃縮、冷凍干燥后得到黃酮粗提物，得率為10.689%。精確稱取0.20 g冷凍干燥后的黃酮粗提物，溶于2 mL 15%乙醇后過0.45 μm的微孔濾膜過濾后上樣于Sephadex LH-20層析柱。其中，Sephadex LH-20層析柱為自裝柱，精確稱取40 g Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠，95%乙醇浸泡24 h使其充分溶脹。以濕法上柱，用15%乙醇洗脫液充滿整個柱子，用4 倍柱體積的15%乙醇洗脫使柱子達到平衡效果。黃酮成分洗脫溶劑為15%乙醇，洗脫液流速0.4 mL/min，逐管收集洗脫液（8 min/管），在283 nm波長處測定吸光度并繪制洗脫曲線，收集合并相同組分，濃縮、凍干后測得柚皮苷得率為4.132%。

1.3.2 純化組分的鑒定

參照胡陽等[14]的方法進行液相色譜分析，參照Yang Yuanfan等[15]的方法進行質譜鑒定，參照周濃等[16]的方法于4 000～400 cm－1波數范圍內測定紅外光譜。

1.3.3 純化組分對胰脂肪酶抑制率的測定

參照Du Xiping等[17]的方法稍做修改。取170 μL的Buffer A、6 μL的胰脂肪酶溶液和20 μL不同質量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、2.5、5.0、10.0 μg/mL）的柚皮苷溶液于96 孔板中，在37 ℃的恒溫振蕩器中溫育15 min后，加入4 μL 6 mmol/L底物4-硝基苯基丁酸酯（4-nitrophenyl butyrate，p-NPB），再次放入37 ℃恒溫振蕩器中溫育15 min后，在405 nm波長下測定其吸光度。根據測定得到的標準曲線（Y=0.002 8X+0.007 8，R2=0.999 2）計算產物PNP的質量濃度。在實驗過程中，采用奧利司他（質量濃度為0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL）作為陽性對照。每個實驗重復3次，胰脂肪酶抑制率計算如式（1）所示。

式中：A1為胰脂肪酶與樣品混合物的吸光度；A2為加樣品不加胰脂肪酶（PBS溶液替代）混合物的吸光度；A3為加胰脂肪酶不加樣品混合物（PBS溶液替代）的吸光度；A4為不加胰脂肪酶和樣品混合物（PBS溶液替代）的吸光度。

Buffer A溶液配制：稱取6.05 g三羥甲基氨基甲烷，溶于450 mL超純水中，用鹽酸緩慢滴定至pH值為7.0，再加入2.775 g的無水氯化鈣并使其充分溶解，待溶液冷卻至室溫后，定容至500 mL備用。

Buffer B溶液配制：稱取1.05 g 3-嗎啉丙磺酸，溶于450 mL蒸餾水，再加入100 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的NaOH溶液，用鹽酸調節至pH值為6.8，待冷卻至室溫后，定容至500 mL。

底物p-NPB溶液配制：稱取12.55 mgp-NPB，溶于10 mL DMSO溶液，配制成濃度為6 mmol/L的p-NPB溶液。

胰脂肪酶液配制：稱取20 mg胰脂肪酶，加入6 mL Buffer B緩沖液溶解，配制成濃度為100 U/mL的酶溶液。

1.3.4 純化組分的胰脂肪酶抑制動力學測定

純化組分的胰脂肪酶抑制動力學測定參照Moreno-Gordova等[18]的方法。取170 μL的Buffer A、20 μL不同質量濃度（0、0.6、0.8、1.0 μg/mL）柚皮苷和6 μL不同濃度胰脂肪酶（0、30、40、50、60 U/mL）于96 孔板中，在37 ℃恒溫振蕩器中溫育15 min后，加入4 μL底物p-NPB（6 mmol/L），再次放入37 ℃的恒溫振蕩器中溫育15 min后取出，在37 ℃下測定405 nm波長處的吸光度，確定反應速度。以不添加柚皮苷為對照組，添加不同質量濃度柚皮苷為實驗組，每個實驗重復3次，以胰脂肪酶溶液濃度為橫坐標，酶促反應初速度為縱坐標作圖，以所得線性擬合曲線是否通過坐標原點為判斷依據，判斷胰脂肪酶的抑制作用。根據上述的操作步驟，固定胰脂肪酶濃度為50 U/mL，改變底物p-NPB濃度（0、2、4、6、8 mmol/L），分別測定不同濃度柚皮苷（0、0.6、0.8、1.0 μg/mL）的酶促反應速率。每個實驗重復3次，以p-NPB底物濃度的倒數為橫坐標，反應速率的倒數為縱坐標繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，獲得米氏常數和酶促反應的最大速率，根據擬合得到的直線與坐標軸交點位置判斷胰脂肪酶的抑制類型。以奧利司他為陽性對照，方法同上，測定奧利司他的胰脂肪酶抑制動力學。以雙倒數曲線的斜率（k）為縱坐標，抑制劑質量濃度為橫坐標，進行二次作圖繪制可得抑制常數Ki。

競爭性抑制劑的抑制常數按照式（2）進行計算。

式中：1/[S]為p-NPB底物濃度的倒數/（L/mmol）；1/V為反應速率的倒數/（L·min/μmol）；Km為米氏常數/（mmol/L）；Vmax為酶促反應的最大速率/（μmol/（L·min））；ρ為抑制劑質量濃度/（μg/mL）。

非競爭性抑制劑的抑制常數可以按照式（3）進行計算。

Lineweaver-Burk雙倒數曲線的斜率k計算見公式（4）。

1.3.5 純化組分與胰脂肪酶的分子對接研究

通過Discovery Studio 2019、Auto Dock 4.2等分子對接軟件進行分子對接。其中，胰脂肪酶（蛋白質結構數據庫ID：1GPL）的晶體結構是從蛋白質晶體結構數據庫（http://www.pdb.org/）獲得的，底物p-NPB和抑制劑的結構均從NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得。對接前分別對受體蛋白和配體進行刪除水分子、加氫等處理，用Auto Dock 4.2軟件對配體和蛋白晶體進行對接，用Discovery Studio 2019軟件顯示對接結果。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3次，采用Microsoft Office Excel 2010軟件對實驗數據計算平均值、標準差，并制圖。

2 結果與分析

2.1 黃酮組分的分離純化及鑒定結果

相關研究表明，植物中普遍含有一定量的黃酮物質，甘蔗皮中黃酮含量為9.83 mg/g[19]，山楂中黃酮含量為22.68 mg/g[20]，琯溪蜜柚黃酮含量高達70. 69 mg/g[13]。與其他水果相比，琯溪蜜柚的黃酮含量相對較高。本研究采用Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖柱層析對琯溪蜜柚柚皮黃酮粗提物進行分離純化，洗脫收集得到兩個組分（圖1A），其中第一個組分（5～50管）含有多個沒有分開的小峰，第二個組分（80～110管）峰型單一，峰面積占所有組分的50%以上，為主要黃酮成分。組分I、II的液相色譜分析結果如圖1B所示，其中組分I出峰多、峰型雜，說明組分復雜。組分II只有一個峰，并且峰型好，說明是單一物質；經過與柚皮苷標準品比對，發現兩者具有相同的保留時間，初步鑒定為柚皮苷。將組分II進行質譜分析，可知組分II的準分子離子峰[M+Na]+為603.00，與柚皮苷標準品的準分子離子峰一致（圖1C），進一步顯示組分II是柚皮苷。FTIR分析顯示，組分II在3 343.29 cm－1處吸收峰為—OH的伸縮振動峰，2 932.67 cm－1處吸收峰為芳香環的C—H的伸縮振動峰，1 654.53 cm－1處吸收峰為C=O的伸縮振動峰，1 460.27 cm－1處吸收峰為苯環的伸縮振動峰，1 159.35 cm－1處吸收峰為C—O的伸縮振動峰，861.30 cm－1處吸收峰為=C—H的伸縮振動峰（圖1D），這些結果與馬娟娟[21]測定柚皮苷的FTIR吸收峰的振動頻率相似。綜上，通過保留時間、質譜和FTIR分析可得出，分離得到的組分II為柚皮苷。這一結果與張九凱[22]、田靜[23]以及劉佳[24]等發現化州柚、梅州沙田柚、甌柑和胡柚果實中含有一定含量的柚皮苷。相關研究表明，柚皮苷是一種廣泛存在于柑橘水果中安全性很高的黃酮類物質，鮮有報道顯示其有明顯的副作用[25]；因此，與奧利司他等化學合成胰脂肪酶抑制劑容易產生腸道緊迫癥、脹氣和腹痛等不良反應相比，本研究從琯溪蜜柚柚皮中分離純化得到的柚皮苷具有安全性高的優點。

圖1 琯溪蜜柚黃酮物質的葡聚糖凝膠柱層析分離（A）、液相色譜（B）、質譜（C）和FTIR（D）圖Fig. 1 Separation of flavonoids from Guanxi honey pomelo by Sephadex column chromatography (A), and their analysis by liquid chromatography (B),mass spectrometry (C) and infrared spectroscopy (D)

2.2 純化的黃酮組分對胰脂肪酶的半抑制濃度

在酶抑制劑研究中，常用半抑制濃度（halfinhibitory concentration，IC50）值（抑制酶活性50%時所需的測試樣品質量濃度）評價抑制強度[15]；IC50值越低，意味著抑制劑對酶活性抑制能力越強。柚皮苷對胰脂肪酶的抑制作用如圖2A所示，柚皮苷隨著其質量濃度（0～1.4 μg/mL）的增加，對胰脂肪酶抑制作用不斷增強，抑制率與質量濃度呈現線性關系；在柚皮苷質量濃度高于1.4 μg/mL時，其抑制效果趨于平緩。根據實驗數據，在線性范圍內（0.4～1.5 μg/mL）進行線性擬合得到方程為Y=48.663X+1.619 7，R2=0.993 2，計算柚皮苷IC50為0.99 μg/mL。陽性對照奧利司他在線性范圍內（2.0～5.0 μg/mL）擬合得到方程為Y=14.758X－8.287，R2=0.992 3，計算IC50值為3.95 μg/mL（圖2B）。這說明柚皮苷對胰脂肪酶的抑制效果明顯強于陽性對照奧利司他對胰脂肪酶的抑制效果。此外，柚皮苷的IC50值遠遠低于相關文獻報道水果中提取的蘆丁[26]、原花青素[27]、花色素-3-葡萄糖[28]等對胰脂肪酶的IC50值，表明從琯溪蜜柚中分離純化得到的黃酮（柚皮苷）具有很強的胰脂肪酶抑制效果。

圖2 柚皮苷（A）和奧利司他（B）對胰脂肪酶的抑制作用Fig. 2 Inhibition of naringin (A) and orlistat (B) on pancreatic lipase

2.3 純化組分的胰脂肪酶抑制動力學特征

抑制劑對酶的抑制類型分為不可逆抑制和可逆抑制兩種[27]。不同抑制劑濃度下的酶促反應速度曲線不通過坐標原點為不可逆抑制類型；不同抑制劑濃度下的酶促反應速率曲線均通過坐標原點則為可逆抑制類型[29]。而可逆抑制類型又可根據動力學特征分為競爭性抑制、非競爭性抑制和混合性抑制[30]。繪制Lineweaver-Burk圖，對照組和實驗組的直線相交于縱軸為競爭性抑制，直線相交于橫軸為非競爭性抑制，直線相交于象限內為混合性抑制[31]。相關研究表明，甜橙皮提取物對胰脂肪酶抑制為非競爭性抑制[32]，黑苦莓黃酮提取物對胰脂肪酶表現為混合性抑制[33]。如圖3A所示，不同濃度的柚皮苷在不同胰脂肪酶質量濃度下反應速率的回歸曲線均通過原點，表明柚皮苷對胰脂肪酶的抑制是可逆的。如圖3B所示，1/V和1/[S]的回歸模型是一組交于橫軸的直線，表明柚皮苷對胰脂肪酶的抑制作用類型是可逆非競爭性抑制。該結果與香水蓮花提取物[34]、霜桑葉提取物[35]、金銀花提取物花青素[36]等對胰脂肪酶的抑制類型相似。相關文獻報道非競爭型抑制劑的抑制程度取決于抑制劑的濃度，但底物濃度增加并不能降低抑制劑對酶的抑制程度；而競爭性抑制易受到底物濃度的影響，高濃度底物將減小抑制作用，甚至完全消除抑制效果[37]。本研究表明琯溪蜜柚黃酮提取物對胰脂肪酶是典型的非競爭抑制類型，因此，其抑制作用不會隨著食物中脂肪的濃度增加而減弱，該特性比競爭型抑制劑更有利于控制餐后血脂的增高。

Ki是反映酶和抑制劑復合物的解離難易程度的重要指標，其數值越小，說明抑制劑與酶結合越緊密，酶與抑制劑越難分離，抑制作用越強?；羰佬赖萚38]發現荷葉黃酮化合物對胰脂肪酶抑制類型為非競爭性抑制，Ki=42.2 mg/mL；任秀娟等[39]發現葡萄籽中提取物對胰脂肪酶的抑制類型為非競爭性抑制，Ki=0.94 mg/mL。根據圖3C、D的直線方程可計算出，柚皮苷對胰脂肪酶的抑制常數Ki為0.58 μg/mL；陽性對照奧利司他對胰脂肪酶的抑制常數Ki為6.63 μg/mL。柚皮苷的抑制常數小于陽性對照奧利司他的抑制常數，說明柚皮苷對胰脂肪酶的抑制作用強于陽性對照奧利司他。此外，柚皮苷抑制常數小于霍世欣[38]和任秀娟[39]等測定的荷葉和葡萄籽黃酮對胰脂肪酶的Ki值，表明柚皮苷和胰脂肪酶結合緊密，因此抑制效果強。

圖3 柚皮苷及奧利司他的胰脂肪酶抑制動力學Fig. 3 Pancreatic lipase of naringin and orlistat inhibition kinetics

2.4 純化組分與胰脂肪酶分子作用特征

酶和抑制劑的分子間相互作用有助于從微觀狀態解釋酶的抑制特性，目前研究酶與抑制劑相互作用的技術手段有分子對接、分子動力學模擬、晶體衍射、冷凍電子顯微鏡等技術。在有蛋白晶體結構的條件下，通常采用分子對接分析酶與抑制劑之間的相互作用特征[40]。相關研究表明，當抑制劑直接與底物競爭酶活性中心位點時，抑制類型為競爭性抑制[41]；當抑制劑與酶活性中心外部位點結合，則為非競爭性抑制[42-43]；而當抑制劑與胰脂肪酶的活性位點和非活性中心結合，出現雙重抑制能力時表現為混合性抑制[1]。結合自由能是小分子配體與蛋白受體之間的相互作用，自由能越小，配體與蛋白結合得越緊密[44]。目前，相關研究已經測定了胰脂肪酶的晶體結構，其催化活性中心是一個催化三聯體結構，由絲氨酸（serine，SER）-組氨酸（histidine，HIS）-天冬氨酸（aspartic acid，ASP）組成，具體催化活性位點為SER152、HIS263、ASP176[17]。根據該模型，柚皮苷和胰脂肪酶分子對接結果如圖4所示，其中底物p-NPB與酶的氨基酸殘基蘇氨酸（threonine，THR）78、酪氨酸（tyrosine，TYR）114、SER152、脯氨酸（proline，PRO）180、異亮氨酸（isoleucine，ILE）209、亮氨酸（leucine，LEU）213形成范德華力，與HIS263形成氫鍵相互作用力，與苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）77和PHE215形成Pi-Pi T型鍵（圖4A）；柚皮苷與酶的氨基酸殘基色氨酸（tryptophan，TRP）85、ASP88、甲硫氨酸（methionine，MET）89、天冬酰胺（asparagine，ASN）92、谷氨酰胺（glutamine，GLN）95、ILE267、谷氨酸（glutamic acid，GLU）268、SER272、ASN276、SER332形成范德華力，與ASN334、HIS264、ASP333形成氫鍵相互作用力，與PHE335形成Pi-烷基鍵，與HIS271形成Pi-碳離子鍵，與LEU275形成Pi-陰離子鍵（圖4B）。對比發現，底物p-NPB與酶活性中心催化位點SER152、HIS263相結合，而抑制劑柚皮苷與酶催化活性中心之外的位點結合，符合非競爭性抑制作用特征，此分子對接結果與圖3B所示的抑制動力學結果一致。此外，柚皮苷與胰脂肪酶結合的自由能為－30.14 kJ/mol，胰脂肪酶與底物p-NPB的結合自由能為－27.21 kJ/mol，而陽性對照奧利斯他與胰脂肪酶結合的自由能為－19.25 kJ/mol，該結果說明柚皮苷對脂肪酶的結合能力明顯強于底物p-NPB和陽性對照奧利司他，該結果與圖3C所示的柚皮苷Ki結果相一致。

圖4 胰脂肪酶與底物p-NPB（A）和柚皮苷（B）的分子對接2D模型Fig. 4 2D model of molecular docking between pancreatic lipase and the substrates 4-nitrophenyl butyrate (p-NPB) (A) and naringin (B)

3 結 論

本文通過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜法分離純化以及用液相色譜、液相色譜-質譜聯用、FTIR等方法鑒定了從琯溪蜜柚中純化得到的主要黃酮組分為柚皮苷，其對胰脂肪酶IC50為0.99 μg/mL，抑制類型為可逆非競爭型，抑制常數Ki=0.58 μg/mL，結合自由能為－30.14 kJ/mol，主要通過范德華力、疏水相互作用、氫鍵、π鍵等作用力與酶催化活性中心之外的位點相結合。該結果說明琯溪蜜柚主要黃酮成分柚皮苷是一種高效安全的胰脂肪酶抑制劑，可為深入理解琯溪蜜柚及其他柑橘類水果抑制肥胖的功能提供理論依據，同時有助于從琯溪蜜柚等水果中開發安全高效的胰脂肪酶抑制劑。