α-松油醇對指狀青霉抑霉唑抗性菌株Pdw03的抑制作用

歐陽秋麗，劉洋梅，陳 悅，陶能國

（湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105）

指狀青霉引起的綠霉病是柑橘采后貯藏期間的主要病害，主要通過化學殺菌劑控制[1-5]。在柑橘采后商品化處理過程中，化學殺菌劑如抑霉唑等的廣泛使用容易導致大量抗藥性菌株的出現。有研究表明，2000—2010年的10 年間，浙江地區抗抑霉唑（imazalil-resistant，IMZ-R）菌株頻率從2.1%增加到60%～84%[4]。2012年監測數據顯示，江西贛州地區指狀青霉的抑霉唑抗性菌系比例高達90%[5]。這些抗藥菌株的出現致使原有劑量防治效果下降甚至失效，導致病害防控難度加大，同時也帶來嚴重的食品安全問題[2-5]。研究發現，植物精油及其組分具有高活性、高安全性、不易誘導菌株產生耐藥性等優點，已逐漸被應用于果蔬采后病害的防治實踐[6-13]。

α-松油醇廣泛存在于茶樹油、松針油中，對多種細菌和真菌具有較強的抑制作用[8,14-19]。章斌等[14]測得α-松油醇對大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）分別為3.9 μL/mL和1.0 μL/mL。Pinto等[15]發現α-松油醇對假絲酵母菌屬（Candidaspp.）、新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）、煙曲霉（Aspergillusfumigatus）和黃曲霉（A.flavus）有很好的抑制效果，MIC和最小殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）的范圍為0.64～1.25 μL/mL。前期研究表明，濃度分別為8.00、8.00 μL/mL和4.00 μL/mL的α-松油醇可完全抑制指狀青霉（Penicillium digitatum）、意大利青霉（P. italicum）和柑橘酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）的生長，并導致真菌形態發生不可逆的有害改變、膜結構紊亂和膜流動性增加[8,16-17]。盡管α-松油醇的抑菌性能已有較多報道，但其對指狀青霉抑霉唑抗性菌株的抑菌機理研究較少。

麥角固醇是真菌細胞膜的重要結構物質，在維持真菌細胞膜結構完整性、流動性和細胞活力等方面起著至關重要的作用，其生物合成受到一系列基因的轉錄調控[1,4]。萜類物質如檸檬醛、橙花醇和芳樟醇等可顯著降低多種果蔬采后病原真菌細胞膜中麥角固醇的含量，導致細胞膜功能異常[13,20-21]。固醇14-α-脫甲基酶基因（CYP51B）是真菌麥角固醇生物合成的關鍵基因之一，也是常見化學殺菌劑（抑霉唑和咪酰胺等）的作用靶標，該酶活性受到抑制能干擾真菌麥角固醇合成，導致細胞膜結構破損，從而引起細胞凋亡[4]。指狀青霉Pdw03菌株為IMZ-R3型抑霉唑抗性菌株，因一段199bp序列插入CYP51B啟動子區引起CYP51B的過度表達而產生抗藥性[4]。本研究主要探討α-松油醇對Pdw03的抑制作用及其對細胞膜結構物質麥角固醇合成的影響，以期為柑橘貯藏期間病害的可持續治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

抑霉唑抗性菌株指狀青霉Pdw03（P. digitatumPdw03）由浙江大學李紅葉教授提供，現保藏于湘潭大學生物與食品工程專業實驗室，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上保存待用。

湘西椪柑（Citrus reticulataBlanco cv. Ponkan）果實于2019年12月21日從湖南省瀘溪縣張家坪村果園采摘，選擇大小均一、著色均勻且無病斑果實作為后續實驗材料。

α-松油醇（90%）購自美國Sigma-Aldrich公司。所有化學藥品均為分析級。

1.2 儀器與設備

TDL5A臺式大容量冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司；CoolSafe 110-4L真空冷凍干燥機 丹麥LaboGene公司；2010QP-Plus氣相色譜-質譜聯用儀、LC-20AT高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）儀日本島津公司；ECLIPSE TS100熒光顯微鏡日本NIKON公司；SPX-250B生化培養箱、MLS-3020手提式壓力蒸汽無菌器 上海博迅實業有限公司；RE-2000A旋轉蒸發儀 上海雅榮生化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1α-松油醇對Pdw03抑制作用的測定

采用瓊脂稀釋培養法[10]測定α-松油醇對Pdw03菌絲體生長的影響。α-松油醇終濃度分別為0（對照組）、1.00、2.00、4.00 μL/mL和8.00 μL/mL。每個培養皿中心接入1個直徑為6.0 mm的菌餅，在（25±2）℃恒溫培養箱培養96 h，每天固定時間測量其菌落直徑，并計算其抑制率。MIC為培養2 d時完全沒有生長的最低濃度，MFC為生長4 d時完全沒有生長的最低濃度。對照組中加入相應體積的0.5%（體積分數）吐溫-80，每一濃度進行3次重復實驗。抑制率計算如公式（1）所示。

式中：dc為對照組菌落直徑/mm；dt為處理組菌落直徑/mm。

1.3.2α-松油醇對椪柑綠霉病發病率影響的測定

發病率測定參照OuYang Qiuli等[11]的方法。浸泡液配制：將α-松油醇均勻溶于果蠟中，最終α-松油醇的濃度為MFC和5 MFC，同時設置對照組（未添加α-松油醇）。

椪柑用自來水洗凈后，在體積分數2%的NaClO溶液中浸泡2 min，用蒸餾水洗凈并自然晾干。晾干后的椪柑用無菌手術刀在赤道處對稱劃2個傷口（3 mm×2 mm）。接種10 μL濃度為1×105個/mL的Pdw03孢子懸浮液。接種后的椪柑靜置4 h后，在相應濃度的浸泡液中浸泡1 min，對照組為果蠟浸泡組。椪柑貯藏溫度為（25±2）℃，相對濕度為85%～90%，每組10個果實，重復3次。每天測定椪柑發病率和病斑直徑，并通風1 h。發病率計算見公式（2）。

1.3.3α-松油醇對Pdw03細胞膜完整性影響的測定

細胞膜完整性的測定參照OuYang Qiuli等[12]的方法。將Pdw03孢子在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（potato dextrose broth，PDB）中培養48 h后，將菌絲體用無菌水洗滌3次，使用3 層紗布過濾收集菌絲體。將收集的菌絲體重懸于磷酸緩沖液（pH 7.0）中，加入終濃度為0（對照）和1/2 MIC的α-松油醇處理0、30、60 min。將處理后的菌絲體用無菌水洗滌3次后收集備用。菌絲體用質量濃度10 μg/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）在30 ℃下染色5 min。染色后將菌絲體用PBS洗滌兩次去除殘留的染料，使用熒光顯微鏡觀察。

1.3.4α-松油醇對Pdw03麥角固醇含量影響測定

麥角固醇含量測定參照OuYang Qiuli等[13]的方法。用終濃度為0（對照）和1/2 MIC的α-松油醇處理0、30、60 min菌絲體，用真空冷凍干燥機凍干，得到干燥菌絲。取0.008 g的干燥菌絲，充分研磨后加入4 mL 25%（質量分數）NaOH溶液和8 mL無水乙醇，在85～90 ℃下水浴2 h?；旌衔锢鋮s至室溫后用石油醚萃取3次。將萃取液用飽和NaCl溶液洗滌3次，用旋轉蒸發儀減壓濃縮近干。殘留物用無水乙醇溶解后用進行HPLC檢測。麥角固醇含量以菌絲干質量計，單位為mg/g。

HPLC檢測條件：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣體積：20 μL。流動相：純甲醇，檢測波長為282 nm。

1.3.5α-松油醇對Pdw03麥角固醇合成途徑相關基因表達量的測定

收集用濃度為0（對照）和1/2 MIC的α-松油醇處理30 min的菌絲體，采用Trizol法提取總RNA，反轉錄成cDNA后進行熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分析。熒光定量PCR程序：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃延伸15 s循環40次，最后60 ℃延伸1 min。參照基因為actin，引物序列如下：ERG9：5’-TCTTTGTTGAGGCCGGGTTTACTTGGGGCGTTTC AACAGA-3’；ERG1：5’-ATCCCCGATAACCTGCCTC TCCCTTGACGCCTCCATTCTT-3’；ERG7：5’-GCGC TGGCGATTGGTCGATGCAGGCCCAGTTTCCGGGCT CC-3’；ERG11：5’-GCGGAATCAAGAGGGACGATGCC CTAGCACACACTTCAGA-3’；ERG24：5’-AGAGCTTC ACAGTTCCAGCCCGATGCCTCGCTGACAAATG-3’；ERG25：5’-ATCGAAAGCTTCCTACGGGGGCGCATCA ATAGGCTGAGGA-3’；ERG26：5’-ACCAGACCCCCTG CATCTATTTGGGATCCGTGCTCTAGGA-3’；ERG27：5’-TTTCGATCTGCTGCCGTCTTGCGCGCTTCGAGTTG TAAAT-3’；ERG6：5’-TCTTTGTTGAGGCCGGGTTTAC TTGGGGCGTTTCAACAGA-3’；ERG3：5’-CAGGCCAT GGCCGCAATGCCGGTGCAGGCCACGGTGGATCC-3’；ERG5：5’-TCTCGCCATTGGCGGATGCGGGCCAACA ATGGCGCCCTTG-3’；ERG4：5’-GCTGGAACCGCTA CTTCCTTAGACAAACAGGTAGGCGACG-3’；ERG2：5’-ACATCTTCGACCCGGAACACTTGGGACCGACTTT CTGCTC-3’；actin183：5’-TGCGCTGAACCGAACTGC CGTCGGGAGCCTCGAAGCGCTC-3’。用2－ΔΔCT法進行基因表達量的定量分析[22]。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復3次，使用Excel 2016軟件處理數據，以平均值±標準差表示。采用軟件SPSS 16.0進行統計分析，one-way ANOVA分析數據顯著性差異（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 α-松油醇對菌株Pdw03的抑制作用

由表1可知，α-松油醇對Pdw03菌絲體的抑制作用隨著濃度增加而增強。在整個培養時間內，1.00～2.00 μL/mLα-松油醇能不同程度抑制Pdw03菌絲體的生長。培養2 d和4 d時，4.00 μL/mLα-松油均能完全抑制Pdw03菌絲體生長，說明α-松油醇對Pdw03的MIC和MFC均為4.00 μL/mL。

表1 α-松油醇對菌株Pdw03的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of α-terpineol on Pdw03

2.2 α-松油醇對椪柑果實綠霉病發病率的影響

由表2、圖1可知，對照組椪柑果實從接種到果實所有傷口發病需要6 d，不同濃度α-松油醇能不同程度影響椪柑果實綠霉病發生。貯藏3 d時，對照組和MFCα-松油醇處理組的椪柑果實開始發病，發病率分別為8%和3%，腐爛直徑分別為（0.78±0.60）mm和（0.27±0.46）mm，此時5 MFCα-松油醇處理組未發??；貯藏4 d時，5 MFCα-松油醇處理組椪柑果實開始發病，發病率為23%，腐爛直徑為（2.09±0.34）mm，而對照組果實發病率已升至73%，病斑直徑達到（9.35±2.97）mm（表2、3）。發病率和發病直徑的結果表明，α-松油醇處理能有效降低綠霉病的發生。

表2 α-松油醇對接種菌株Pdw03椪柑果實綠霉病發病率的影響Table 2 Effect of α-terpineol on the incidence of green mold in ponkan fruit inoculated with Pdw03

表3 α-松油醇對接種菌株Pdw03椪柑果實病斑直徑的影響Table 3 Effect of α-terpineol on lesion diameter in ponkan fruit inoculated with Pdw03

2.3 α-松油醇對菌株Pdw03細胞膜完整性的影響

真菌細胞膜通透性可用PI染色的方法來判定。正常情況下，PI不能穿過完整的細胞膜，但當細胞膜完整性喪失后，PI可自由進入細胞內與DNA結合釋放紅色熒光，因此常用來檢測細胞膜完整性[10]。α-松油醇處理對Pdw03細胞膜通透性的影響如圖2所示。與對照組相比，1/2 MICα-松油醇處理30 min時可觀察到大部分菌絲呈現紅色熒光，表明細胞膜透性增加；隨著處理時間延長到60 min，1/2 MICα-松油醇處理組菌絲出現明亮的紅色熒光（圖2），說明α-松油醇處理可顯著破壞Pdw03細胞膜完整性。

圖2 α-松油醇對菌株Pdw03細胞膜完整性的影響Fig. 2 Effect of α-terpineol on the cell membrane integrity of Pdw03

2.4 α-松油醇對菌株Pdw03麥角固醇含量的影響

麥角固醇是真菌細胞膜的重要結構物質，有助于維持真菌細胞膜結構完整性和流動性[13,20-21]。圖3結果表明，隨處理時間延長，對照組麥角固醇含量基本維持不變，而α-松油醇處理能急劇降低Pdw03麥角固醇含量。1/2 MICα-松油醇處理30 min后，Pdw03麥角固醇含量顯著降低至對照組的40%（P＜0.05），隨著處理時間延長到60 min，這一下降趨勢表現得更加明顯。這些結果表明α-松油醇很可能通過干擾Pdw03菌株麥角固醇生物合成來降低麥角固醇含量，進而影響其細胞膜完整性。

圖3 α-松油醇對菌株Pdw03麥角固醇含量的影響Fig. 3 Effect of α-terpineol on the ergosterol content in Pdw03

2.5 α-松油醇對Pdw03麥角固醇合成途徑相關基因表達的影響

麥角固醇生物合成是一個多基因轉錄調控的復雜生物學過程[13,23-24]。α-松油醇能不同程度影響Pdw03麥角固醇生物合成途徑基因表達。如圖4所示，1/2MICα-松油醇處理30 min后，除ERG1、ERG11、ERG26和ERG27基因表達基本未受影響外，其余基因表達均受到顯著影響。其中，ERG9基因表達受到顯著抑制，表明其可能為潛在作用位點；而ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG7、ERG24和ERG25等基因表達顯著增強（P＜0.05）。ERG3的表達量急劇上升，其次為ERG6和ERG5，其他上調基因雖然轉錄水平發生顯著變化，但變化幅度不如這3個基因，出現這一結果可能與真菌能通過上調麥角固醇合成途徑某些基因的表達緩解麥角固醇合成抑制類藥物對細胞膜的損傷有關[25-27]。

圖4 α-松油醇對Pdw03麥角固醇合成途徑相關基因表達的影響Fig. 4 Effect of α-terpineol on gene expression related to ergosterol synthesis pathway in Pdw03

3 討 論

已有研究表明，α-松油醇具有顯著的抑菌活性和防腐作用[8-9,14-19]。本研究結果發現4.00 μL/mL（MFC）α-松油醇能完全抑制Pdw03菌絲的生長（表1），且MFC和5 MFC濃度的α-松油醇能夠有效控制綠霉病的擴展（表2、3和圖1）。這一結果與Kong Qingjun等[9]在葡萄中赭曲霉（A. ochraceus）防控的研究結果相似，其發現α-松油醇能有效抑制赭曲霉的生長，并對葡萄貯藏過程中赭曲霉的生長具有顯著的抑制作用。

真菌細胞膜是細胞賴以生存的重要基礎[28]。有報道指出，植物精油能通過其親脂性影響細胞膜通透性發揮抑菌作用[20,29]。前人研究發現，α-松油醇處理不僅能引起大腸桿菌細胞膜透性增加，導致β-半乳糖苷酶外流[18]，而且還可以誘導赭曲霉和黃曲霉細胞膜透性增加，引起金屬離子泄漏和細胞膜完整性破壞，導致代謝紊亂[9,19]。本研究也發現，2.00 μL/mL的α-松油醇處理嚴重地破壞了Pdw03細胞膜完整性（圖2）。這一結果與本課題組前期研究結果一致，即α-松油醇可引起意大利青霉膜結構紊亂和膜流動性增加[17]。

麥角固醇是保持真菌細胞膜結構完整性的關鍵物質之一，參與細胞膜透性和流動性的調節[28,30-31]，也是多種抗真菌藥物的主要目標。防治柑橘采后綠霉病的常見化學殺菌劑（如抑霉唑和咪鮮胺）的作用靶標即為麥角固醇代謝途徑，主要通過干擾麥角固醇生物合成的不同環節或直接與麥角固醇絡合干擾其正常功能，從而影響病原微生物生長[21,29]。大量研究表明，植物精油及其組分如姜黃精油、檸檬醛、橙花醇和紫蘇醛等也能通過干擾麥角固醇合成對細胞膜完整性產生影響，引起細胞毒害[13,20-21,25,32-34]。本研究中，α-松油醇處理能顯著降低Pdw03菌株麥角固醇含量（圖3），與細胞膜完整性被破壞的結果相互印證。

麥角固醇的生物合成受到ERG基因的嚴格調控[23-24,34]。Xu Yanqun等[21]指出，芳樟醇處理引起草莓灰霉菌的麥角固醇合成途徑限速酶基因ERG1和ERG3表達下調，細胞膜中麥角固醇的含量降低，導致細胞膜完整性受損。前期研究發現，檸檬醛處理指狀青霉抑霉唑敏感菌株后，ERG7基因的表達被激活，而ERG3、ERG5、ERG6和ERG11基因的表達被抑制，其中ERG11基因是導致麥角固醇含量降低的關鍵基因[13]。與檸檬醛不同的是，α-松油醇處理并未誘導ERG11的表達發生顯著變化（圖4），表明α-松油醇的作用位點可能不是ERG11，說明不同類型萜類物質對真菌麥角固醇途徑的調控位點存在差別。在真菌麥角固醇代謝途徑中，ERG9基因編碼角鯊烯合成酶，其主要催化固醇分支途徑的第一步反應，對細胞生長至關重要，當該基因被破壞時，細胞將喪失合成固醇的能力[23-24,34]。α-松油醇處理顯著抑制Pdw03ERG9表達（圖4），這一結果與衛夢綺[34]報道的枯茗醛能通過抑制黃曲霉ERG9基因表達下調麥角固醇含量類似，說明ERG9基因表達下調引起的麥角固醇含量降低很可能與指狀青霉Pdw03菌株細胞膜完整性喪失密切相關。α-松油醇處理還誘導了多個麥角固醇合成基因的上調表達，其中ERG3、ERG5和ERG6的變化最為顯著（圖4）。ERG3編碼C-5固醇去飽和酶，該基因一旦失活將導致麥角固醇合成不足和中間代謝產物積累[23-24]。ERG5編碼的C-22固醇去飽和酶催化固醇側鏈中C-22/23雙鍵的形成，該雙鍵在麥角固醇生物合成途徑中至關重要[13]，缺失該基因會導致粗糙脈孢菌和輪枝鐮孢菌對酮康唑的高度敏感[24]。ERG6編碼的C-24固醇甲基轉移酶是麥角固醇合成代謝途徑中的重要限速酶，ERG6的高表達可以有效提高細胞麥角固醇含量[24]。這些基因與其他麥角固醇合成途徑基因ERG2和ERG4表達同時上調能有效增加麥角固醇含量[27]。此外，ERG7的表達能促進羊毛固醇的生成，而ERG25表達的上調有助于菌株將羊毛固醇轉化為麥角固醇[26]。盡管上述基因的上調表達可部分補償因ERG9表達受抑制對麥角固醇合成造成的不利影響，但并不能完全補償ERG9表達下調帶來的麥角固醇含量降低，隨著時間延長這一現象表現的尤為明顯，最終表現為麥角固醇合成途徑受阻，麥角固醇含量降低，從而導致細胞膜完整性喪失和菌絲體凋亡。