苯乳酸對具核梭桿菌的抑菌效果及機制

孔祥麗，馬巖石，吳昕雨，許曉曦

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）是革蘭氏陰性厭氧菌，擬桿菌科，梭桿菌屬，為人類共生菌。人類口腔、胃腸道等部位均發現其存在，該菌在不同的生態位下其種屬有一定的特異性，屬條件致病菌[1]。已有研究發現，具核梭桿菌與牙周疾病直接相關，其在口腔菌斑生物膜的形成中起到重要連接作用，且可協同其他口腔致病菌產生內毒素及刺激因子，誘導炎癥發生[2-3]。Fn本身除了導致炎癥因子上調，誘發口腔癌[4]，亦是結腸直腸癌、宮頸癌、乳腺癌等疾病的重要關聯菌[5-8]。Kashani等[9]對伊朗的80名Fn感染者分析發現，該菌可產生的特殊黏附素FadA，易形成生物膜。

苯乳酸作為天然有機酸，可以由部分乳酸菌通過苯丙酮酸在乳酸脫氫酶作用下產生[10]或由非乳酸菌如白地霉等產生[11]，其結構穩定，可耐受高溫等不良條件[12]，為天然、安全的抗菌劑[13]，能夠有效抑制細菌、真菌的生長，在抑制單增李斯特菌[14]、大腸桿菌[15]、陰溝腸桿菌[16]、糞腸球菌[16]、金黃色葡萄球菌[16]等方面均有報道。由此表明，該生物有機酸在抑菌方面具有良好的應用潛力，但目前苯乳酸對Fn的抑菌作用及機制鮮有深入探究。

本課題組前期研究了200余種乳酸菌代謝產物對Fn的抑菌性，發現Lactobacillus rhamnosusGG、L. caseiM3和L. plantarumYYC-3的抑菌作用最好。此外，本團隊前期研究還發現有關乳酸菌代謝產物對結直腸癌的預防調控作用中，植物乳桿菌的代謝產物對Fn導致的結直腸癌的預防作用最強[17]；研究發現，植物乳桿菌LY-78代謝產物中的多種有機酸有一定的抑菌作用，經對比分析可知植物乳桿菌的抑菌性與其產生的天然有機酸苯乳酸相關[18]；此外，本課題組還研究了苯乳酸對陰溝腸桿菌、糞腸球菌生物膜的抑制能力，從破壞細胞膜角度出發，詳細探究了苯乳酸對這兩種菌的抑菌作用[19]。

鑒于Fn對于結腸癌等惡性腫瘤細胞的保護及促生長和轉移的特性[20]，以及其可能于腸道形成生物膜對健康造成的威脅，本實驗探究苯乳酸對Fn的生長抑制和破壞其形成生物膜的能力，在苯乳酸抑菌方面有重要的現實意義和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

具核梭桿菌ATCC 25586 北京北納創聯生物技術研究院；L-3-苯乳酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫乙醇酸鹽液體培養基 青島海博生物技術有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染液 美國Beckman Coulter公司；總蛋白（total protein，TP）測定試劑盒南京建成生物工程研究所；75%（體積分數）乙醇、95%（體積分數）甲醇、冰乙酸、0.5%（質量分數）結晶紫染色液、甘油、4%（質量分數）多聚戊二醛、純叔丁醇北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen全自動生長曲線分析儀 芬蘭Growth Curves公司；JBQ-ZD全溫振蕩培養箱 常州普天儀器制造有限公司；LC-85C隔膜式抽氣泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；GI54DWS高壓滅菌器 美國致微儀器有限公司；3K 15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；PB-10酸度計 北京賽多利斯科學儀器；SU8010場發射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；SpectraMax i3x多功能酶標儀 上海美谷儀器有限公司、UV752N紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限；Mini VIDAS全自動熒光免疫分析儀 塞力斯醫療科技股份有限公司；Accuri C6 plus流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 Fn活化及培養

將200 μg Fn凍干菌粉接入10 mL液體硫乙醇酸鹽培養基中，在37 ℃、氮氣-二氧化碳（9∶1，V/V）厭氧罐中厭氧培養4 d，使菌種恢復活力，將活化后的菌種以5%（體積分數）接種量接種至新鮮培養基，相同條件下厭氧培養，每隔48 h傳一代，傳代2次后將菌液離心（1 000×g、5 min），得到菌體沉淀，用新鮮培養基重懸并調整菌體濃度為1×106CFU/mL備用。

1.3.2 Fn生長曲線的測定

參照文獻[21]測定Fn生長曲線，在100 孔蜂窩板內按照200 μL/孔添加1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL），設置6個復孔，37 ℃、氮氣-二氧化碳（9∶1，V/V）條件下厭氧培養（后續厭氧條件同）48 h，利用Bioscreen全自動生長曲線分析儀每隔30 min測定菌液在600 nm波長處的光密度值OD600nm，得到Fn生長曲線確定該培養條件下Fn的生長對數期。

1.3.3 苯乳酸最小抑菌質量濃度及最小殺菌質量濃度的測定

參照Kang Shimo等[22]的方法測定苯乳酸對Fn的最小抑菌質量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌質量濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。在100 孔蜂窩板內按照200 μL/孔添加1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL），按照22 μL/孔分別添加不同質量濃度的苯乳酸溶液（終質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL），厭氧培養24 h，采用Bioscreen全自動生長曲線分析儀每隔2 h測定1次OD600nm，記錄Fn的生長情況。在96 孔板內按照100 μL/孔添加1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL），按照11 μL/孔分別添加不同質量濃度的苯乳酸溶液（終質量濃度為0、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0 mg/mL），厭氧培養0、24、48 h后用多功能酶標儀測定菌液OD600nm，并將48 h后測出OD600nm無明顯變化的菌液均勻涂到血平板中，厭氧培養72 h，根據菌落生長的情況來確定MIC和MBC。

1.3.4 苯乳酸的抑菌作用研究

1.3.4.1 菌體形態的觀察

先將無菌玻璃爬片（φ=8 mm）放入48 孔板中，按照250 μL/孔添加1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL），厭氧培養24 h后，每孔加入27.8 μL用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L、pH 7.2，下同）溶解的苯乳酸溶液，苯乳酸終質量濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以等體積PBS做空白對照，處理2 h后吸棄溶液，添加預冷處理后的固定液，于4 ℃冰箱中放置8 h。吸棄孔板中的固定液，滴加PBS清洗，浸沒爬片后靜置10 min，重復3次。吸棄PBS后分別依次添加體積分數50%、70%、90%的乙醇溶液靜置10 min，進行脫水處理，然后吸棄乙醇溶液，添加無水乙醇脫水（靜置10 min）兩次，吸棄無水乙醇，添加無水乙醇-純叔丁醇（1∶1，V/V）溶液靜置15 min，吸棄溶液加入叔丁醇靜置15 min，吸棄叔丁醇后再次加入叔丁醇靜置15 min，吸棄叔丁醇后進行凍干、噴金處理[23]，然后將玻璃片放置于掃描電子顯微鏡載物臺進行觀察。

1.3.4.2 Fn上清液蛋白含量和pH值的測定

將1 mL 1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL）離心（1 000×g、3 min）后得到菌體。用1 mL PBS重懸菌體后離心（1 000×g、3 min）棄去上清液，此步驟進行兩次，添加1 mL質量濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mg/mL的苯乳酸溶液，以等體積無菌水做空白對照，厭氧培養2 h后，1 000×g離心5 min，取0.5 mL上清液根據TP測定試劑盒說明書測定蛋白含量，結果以樣品在595 nm處的光密度值OD595nm表示。另外，取5 mL相同處理方法得到的上清液，用PB-10酸度計在20 ℃下測定氧化還原電位（oxidation-reduction potential，ORP）和pH值。

1.3.4.3 Fn細胞膜完整性的測定

取1 mL 1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL）離心（1 000×g、3 min），加入1 mL PBS重懸再次離心（1 000×g、3 min），棄去上清液，分別添加1 mL不同質量濃度（1/2 MIC、MIC）的苯乳酸溶液，以等體積無菌水為空白對照，以等體積十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTMAB）（能溶解革蘭氏陰性菌的細胞膜）作為熒光染色的陽性對照[24]，厭氧培養2 h。分別添加10 μL 1 mg/mL的PI染液，在4 ℃下染色20 min后，1 000×g離心5 min，添加1 mL PBS重懸后離心（1 000×g、5 min），棄去上清液，用200 μL PBS重懸菌體后在全自動熒光免疫分析儀觀察和流式細胞儀分析熒光強度，通過Accuri C6 plus流式細胞儀計算Fn熒光陽性百分率。

1.3.4.4 Fn胞內蛋白的電泳分析

取1 mL 1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL），分別添加111 μL不同質量濃度的苯乳酸溶液（終質量濃度為0.2、0.4、0.8 mg/mL），以等體積無菌水作為空白對照，厭氧培養處理2 h后離心（3 000×g、5 min）得到菌體沉淀。按照10 mL/g添加細菌裂解液（含1%（體積分數）蛋白酶抑制劑的溶菌酶（20 kU/mL）），研磨并反復凍融3次，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，采用5%（質量分數）濃縮膠和10%（質量分數）分離膠，加樣量為20 μL，開始電壓為80 V，30 min后調整電壓為120 V直至實驗結束。電泳結束后采用考馬斯亮藍染色分析Fn菌體胞內蛋白組成的變化。

1.3.4.5 Fn生物膜含量的測定

參考1.3.4.1節方法觀察厭氧培養48 h的空白對照組和MIC苯乳酸（0.1 mol/L、pH 7.2 PBS溶解）處理2 h后Fn的生物膜。采用結晶紫染色法評估Fn的生物膜形成能力。取1.3.1節活化后的菌液（1×106CFU/mL），按照200 μL/孔添加至96 孔板，厭氧培養48 h后分別添加22 μL/孔苯乳酸、乳酸溶液（終質量濃度均為0.5 mg/mL），以等體積無菌水作為空白對照，厭氧培養處理2 h。吸出培養液用于測定pH值；孔內菌體用無菌PBS洗滌3次，除去松散附著的細胞，室溫下干燥。每孔中添加100 μL 95%（體積分數）甲醇固定15 min后，棄去液體并風干。每孔加入100 μL 0.05%（質量分數）結晶紫染色10 min。無菌PBS沖洗3次，風干。添加100 μL/孔的體積分數33%醋酸溶液溶解10 min，在450 nm波長處測定光密度值OD450nm，以表征生物膜含量。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3個重復，實驗結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 26.0軟件中單因素方差分析進行統計分析，采用Duncan多重比較進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2018 9.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 Fn生長穩定期的確定

采用Bioscreen全自動生長曲線分析儀測定Fn在48 h內OD600nm變化，得到細菌的生長曲線，并確定Fn的對數生長期。如圖1所示，經培養6 h后，Fn可達到生長對數期，當培養時間為27 h，菌株達到生長穩定期，因此Fn的最佳生長周期為27 h。在27 h前后選取一個時間點作為后續研究的統一判定時間，即選取24 h和48 h作為判斷苯乳酸抑菌效果的時間點，測定苯乳酸對Fn生長的影響。

圖1 Fn的生長曲線Fig. 1 Fn growth curve

2.2 苯乳酸對Fn的抑制效果

在培養基中加入不同質量濃度的苯乳酸溶液，確定Fn不再生長甚至死亡時苯乳酸的最小質量濃度。如圖2A所示，隨苯乳酸質量濃度的增加，Fn的生長速率減慢。在24 h厭氧培養期間，0.4 mg/mL苯乳酸即導致Fn的生長速率明顯降低，0.7 mg/mL苯乳酸對Fn達到完全抑制，且0.7 mg/mL苯乳酸處理2 h就產生了抑制效果。如圖2B所示，0.4 mg/mL苯乳酸處理0 h和24 h的OD600nm差異較小，苯乳酸質量濃度大于0.4 mg/mL即可在短時間內完全抑制Fn生長。加入0.5 mg/mL苯乳酸厭氧培養24 h和48 h后OD600nm差異不明顯。因此，苯乳酸對Fn的MIC為0.5 mg/mL。將質量濃度0.5 mg/mL苯乳酸處理48 h后的Fn菌液涂在血平板上，厭氧培養72 h時的菌落計數結果為3.5×103CFU/mL，而質量濃度大于或等于0.7 mg/mL的苯乳酸處理組無活菌檢出，此結果與圖2A結果一致。因此，苯乳酸對Fn的MBC為0.7 mg/mL。

圖2 苯乳酸對Fn生長的影響Fig. 2 Effect of phenyllactic acid on Fn growth

2.3 苯乳酸對Fn形態的影響

Thakur等在納米粒子對細菌作用的研究中采用掃描電子顯微鏡觀察到菌體損傷[25]，孫明明等[26]也采用此技術觀察菌體損傷。因此，為闡明苯乳酸對Fn抑制機制，本研究通過掃描電子顯微鏡成像技術觀察菌體形態變化。

從圖3A可看出，空白對照組的Fn兩端為梭狀，表面光滑。加入1/2 MIC苯乳酸處理后，Fn表面有少量蛋白溶出現象，部分菌體抱團、黏連，菌體表面變得粗糙和部分溶解，表面變得不光滑（圖3B）。經MIC苯乳酸處理后，Fn細胞壁可能受損，細菌形態變得纖細，且表面產生大量凸起（圖3C），推測為胞內物質滲出。經2 MIC苯乳酸處理后，Fn已無法維持正常菌體形態，表面粗糙不平，細胞膜和細胞壁嚴重損壞（圖3D）。由此可推測苯乳酸破壞了細胞膜結構，導致內容物泄漏。

圖3 苯乳酸對Fn菌體形態的影響Fig. 3 Effect of phenyllactic acid on the morphology of Fn

2.4 苯乳酸處理對Fn上清液中蛋白含量、氧化還原電位和pH值的影響

苯乳酸處理后的Fn菌體上清液中蛋白含量（OD595nm）發生變化，推斷為細胞膜透過性受損、細菌內容物溶出[27]，可通過OD595nm反映細胞膜的破壞程度。由圖2可知，苯乳酸質量濃度大于0.4 mg/mL可明顯影響Fn的生長，為探究不同質量濃度苯乳酸對細胞膜通透性的影響，采用0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mg/mL的苯乳酸處理Fn，測定細菌上清液中蛋白含量、ORP、pH值。

由圖4A可知，與空白對照組相比，0.2、0.4 mg/mL苯乳酸處理組上清液中蛋白含量均顯著增加（P＜0.05）。而在更高質量濃度的苯乳酸作用下，與0.4 mg/mL組相比，上清液中蛋白含量顯著減少（P＜0.05），其原因可能是隨苯乳酸質量濃度增加，溶液酸度升高，0.4 mg/mL苯乳酸處理組pH值為5.43±0.01，0.8 mg/mL苯乳酸處理組pH值則為4.50±0.01（圖4B），已低于蛋白質的等電點，由于酸的作用，上清液中的蛋白質發生沉降而含量降低。隨著苯乳酸的質量濃度增加，上清液的ORP總體呈增加趨勢，即氧化性增強，培養基中雜質減少，進一步證明上清液蛋白質發生了沉降。苯乳酸質量濃度低于MIC時（0～0.4 mg/mL苯乳酸），苯乳酸處理質量濃度與上清液蛋白含量呈正相關，表明苯乳酸對Fn的抑制機制可能分為兩方面，一是刺激Fn產生更多胞外分泌蛋白；二是破壞其細胞膜，使細胞內容物外泄。因此，本實驗進一步分析苯乳酸對Fn細胞膜完整性的影響。

圖4 苯乳酸處理Fn后上清液中蛋白含量、ORP、pH值的變化Fig. 4 Changes in protein content, oxidation-reduction potential, and pH in Fn culture supernatant after treatment with phenyllactic acid

2.5 苯乳酸對Fn細胞膜完整性的影響

熒光標記法是通過熒光探針與細胞核內的DNA結合產生特殊的熒光，熒光的數量和強度可反映被測物的含量，流式細胞儀能定量分析該熒光強度，黃云坡等[28]通過這兩種方法綜合評價苯乳酸對單增李斯特菌細胞膜的破壞程度，張宇婷等[29]采用該方法檢測活菌數，本實驗采用同樣方法檢測苯乳酸對Fn細胞膜的通透性及完整性的影響。

PI是一種不能通過完整細胞膜的DNA熒光探針，當細胞膜受損后PI可進入細胞并與DNA結合，在546 nm波長處發出紅色熒光?？瞻讓φ战M的Fn中有少量凋亡，經PI熒光探針染色后，僅出現少許紅色熒光（圖5A），1/2 MIC苯乳酸處理Fn 2 h后，紅色熒光強度有所增加（圖5B），即細胞的通透性增加；MIC苯乳酸處理Fn時，細胞膜損傷程度進一步增加，紅色熒光強度明顯增多，在整個檢測范圍內產生均勻的光斑（圖5C）。同時，將經過CTMAB處理細胞膜的熒光狀態作為陽性對照組（圖5D），與陽性對照組相比，1/2 MIC苯乳酸處理的Fn細胞膜受損程度較小，而MIC苯乳酸處理的細胞膜損傷程度與之接近。

圖5 熒光探針法檢測苯乳酸對Fn細胞膜的破壞作用Fig. 5 Destructive effect of phenyllactic acid on the cell membrane of Fn demonstrated by fluorescent probe method

利用流式細胞儀來檢驗苯乳酸處理后的效果。如圖6所示，空白對照組的Fn熒光陽性率為3.6%（圖6A），為細菌正常代謝凋亡比例，1/2 MIC苯乳酸處理后細胞的熒光陽性率達到10.9%（圖6B），MIC苯乳酸處理后的Fn的熒光陽性率達到51.6%（圖6C），而陽性對照組的熒光陽性率為45.9%（圖6D），該結果與全自動熒光免疫分析儀結果（圖5）一致。綜上所述，苯乳酸破壞了Fn細胞膜的選擇透過性及完整性，細胞膜通透性提高。

圖6 流式細胞術檢測苯乳酸對Fn細胞膜的影響Fig. 6 Effect of phenyllactic acid on Fn cell membrane determined by flow cytometry

2.6 苯乳酸對Fn胞內蛋白的影響

細胞膜不僅可選擇性使大分子進入，也可控制胞內物質流出，檢測Fn胞內蛋白的含量可反映Fn細胞膜控制物質流出的能力?？赏ㄟ^SDS-PAGE檢測胞內蛋白分子質量及含量的變化[30]，從而反映苯乳酸對Fn胞內蛋白的影響。

圖7 Fn胞內蛋白的SDS-PAGE結果Fig. 7 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis patterns of intracellular proteins from Fn

如圖7所示，與空白對照組相比，經過0.2、0.4 mg/mL的苯乳酸處理后Fn中分子質量為130 kDa以上的蛋白數量減少，70 kDa左右蛋白含量增多，說明苯乳酸影響了Fn的代謝過程，改變了蛋白合成途徑。0.8 mg/mL的苯乳酸使其胞內蛋白含量減少，這與之前發現的蛋白質外泄結果相一致，由于細胞膜破損嚴重，相對較大的蛋白分子也流出，導致細菌活性減弱，合成蛋白能力降低，蛋白含量減少。這與寧亞維等[31]探究苯乳酸對假單胞菌細胞膜影響的結果一致。由此證明苯乳酸可破壞Fn細胞膜的完整性。

2.7 苯乳酸對Fn形成生物膜的影響

以往的研究結果表明，Fn可產生大量黏多糖等物質，幫助菌體在細胞表面形成保護層[32]，被歸類為生物膜。生物膜通常為胞外多聚物，目前生物膜的測定公認為結晶紫法[33]，該檢測法價格低廉、簡便且結果準確性高，可直接顯示生物膜的變化[34]。本研究在由Fn形成的生物膜上加入苯乳酸，探究其對生物膜的作用。并通過掃描電子顯微鏡觀察該膜的致密程度和菌體數量變化。

如圖8A所示，經過48 h培養，空白對照組中大量Fn形成致密的生物膜，黏附在培養玻璃片（φ=8 mm）表面，Fn尖端相連，并有所纏繞，PBS清洗不易脫落；但經MIC苯乳酸處理2 h后，視野內Fn數量明顯減少，且生物膜暴露出不規則孔洞，致密程度下降，菌體連接較松散，由空白對照中的纏繞形態轉變為菌體之間的黏連（圖8B），其胞外物質表觀結構出現不規則空隙，表明苯乳酸破壞了該生物膜結構。由此可知，苯乳酸能抑制Fn的生長，進而抑制生物膜的形成，并且能使原有的生物膜脫落和破損，說明苯乳酸對Fn形成的生物膜有良好的消殺作用。

圖8 苯乳酸處理對Fn生物膜形態的影響Fig. 8 Morphology of biofilm produced by Fn

苯乳酸作為有機酸的一種，使溶液呈酸性，前期研究結果顯示其酸性會使蛋白沉降（體系pH值低于等電點），因此，測定相同條件和質量濃度乳酸、苯乳酸處理體系的pH值和形成生物膜含量（OD450nm），并進行對比分析。

表1 苯乳酸和乳酸對Fn形成生物膜的影響Table 1 Effect of phenyllactic acid on biofilm formation of Fn

如表1所示，與空白對照組相比，0.5 mg/mL苯乳酸處理組的生物膜含量顯著降低（P＜0.05）。相同質量濃度苯乳酸和乳酸處理對Fn生物膜的破壞性差異明顯，0.5 mg/mL乳酸處理組的生物膜含量與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。0.5 mg/mL乳酸組的pH值遠低于0.5 mg/mL苯乳酸組，說明苯乳酸對生物膜的破壞性來自于其本身的結構，而非由其酸性導致的。

3 結 論

苯乳酸對Fn具有良好的抑菌能力，其抑菌機制為改變細菌細胞膜的通透性，使胞內蛋白外泄；且苯乳酸降低了Fn的黏附性，對其生物膜亦具有破壞作用。因此，未來可將苯乳酸應用于調控腸道微生態及預防腸道病原菌生物膜引發疾病的功能性食品。