巴氏滅菌對不同油脂體乳液氧化穩定性的影響

武利春，孫禹凡，陳亞雙，閆世長，謝鳳英，齊寶坤,*，李 楊,2,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江綠色食品科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

油脂體是植物儲藏油脂的細胞器，廣泛存在于大豆、葵花、花生等油料作物中，是一種天然的水包油乳液，結構呈球狀，球體內部被油脂占據，球體表面被由蛋白質和單層磷脂構成的生物膜包圍[1]。油脂體除蛋白質（質量分數0.59%～3.46%）、磷脂（質量分數0.59%～1.57%）和油脂（質量分數94.28%～98.17%）外，還有少量的生育酚和植物甾醇等抗氧化物質[2]。覆蓋在油脂體表面的蛋白質能防止油脂體在種子萌芽之前被降解，其中油質蛋白（Oleosin）是含量最多的內源膜蛋白，約占油脂體總蛋白含量的80%，是一種低分子質量（15～26 kDa）堿性蛋白質，其次還有鈣化蛋白（27～29 kDa）和甾醇蛋白（39～41 kDa）[2-3]。Oleosin中央疏水肽鏈嵌入單層磷脂并深入油脂基質中，具有親水性的N端和C端位于油脂體外表面，將油脂體包裹起來[3-6]，油脂體還存在由外源蛋白構成第二層膜，這層膜對維持油脂體穩定起積極作用。Nikiforidis等[7]對比含外源蛋白的玉米胚芽油脂體和不含外源蛋白的玉米胚芽油脂體，得出含外源蛋白的玉米胚芽油脂體平均粒徑更低，抗聚集性更好。

許多研究表明油脂體具有良好的乳化性、營養性和穩定性，可被廣泛應用于食品、藥品和化妝品等乳液體系中，如植物奶[8]、豆腐[9]、蛋黃醬[10]、酶制劑[11]等產品。但在乳液實際加工過程中，滅菌是必不可少的流程。巴氏滅菌是行業內主要的滅菌方式，僅通過簡單加熱就可達到滅活微生物、抑制酶活力、延長產品保質期和保證產品安全性的目的[12]。諸多研究表明熱處理會導致油脂體乳液理化性質發生改變，例如，de Chirico等[13]得出95 ℃加熱6 min的油菜籽油脂體脂肪氧化酶活性顯著降低，油脂體貯藏穩定性顯著提升。Zaaboul等[14]研究表明花生油脂體無論是經巴氏滅菌還是經超高壓滅菌，粒徑并不會顯著改變，而蛋白質、表觀黏度和流動指數均發生顯著改變。Zhao Luping等[15-16]研究發現立即對新鮮大豆油脂體進行巴氏滅菌，油脂體穩定性可顯著提升。目前，研究者多集中對一種油脂體的理化性質研究，而對不同來源的油脂體研究較少。

本實驗分別選取大豆、葵花籽仁、花生仁、芝麻仁和核桃仁作為原料，通過濕法磨漿的方式從原料中分離富集油脂體，通過測定不同油脂體的基本組成、相關蛋白組成和脂肪酸組成，進而探明巴氏滅菌對不同油脂體乳液特性和氧化穩定性的影響，為油脂體在沙拉醬、植物奶等產品中應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆、花生仁、葵花籽、芝麻、核桃均購于哈爾濱市哈達友誼農貿市場；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JJ-2組織搗碎機 常州市國旺儀器制造有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；MODEL BE-210型垂直電泳儀 日本BIO CRAFT公司；Gel Doc EZ凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國萊卡公司；Zetasizer Nano ZS90型粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 提取油脂體和制備巴氏滅菌油脂體乳液

參考文獻[17]方法提取油脂體并稍作修改，大豆、花生仁、葵花籽仁、芝麻仁、核桃仁預先低溫浸泡18 h，籽仁與去離子水按照1∶9（m/V）比例混合磨漿，用4 層紗布過濾，濾液中加入20%（質量分數）蔗糖溶液，接著以14 000×g離心30 min。取上浮乳狀物重新分散于20%（質量分數）蔗糖溶液，在相同條件下離心，該步驟重復3次。富集油脂體分散在去離子水中，在相同條件下離心，該步驟重復3次，以除去油脂體中蔗糖，最終上浮乳狀液為油脂體。

滅菌油脂體乳液的制備：10 g油脂體分散于90 g含有20 mg/mL疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4、10 mmol/L）中，參照文獻[14]的方法對油脂體乳液進行巴氏滅菌，10%（質量分數）的油脂體乳液置于85 ℃水浴鍋中加熱10 min即得滅菌油脂體乳液，以未經巴氏滅菌處理的10%（質量分數）油脂體乳液為對照。

1.3.2 油脂體基本組成測定

對未經稀釋的新鮮油脂體進行基本組成的測定，水分質量分數、蛋白質量分數和油脂質量分數分別參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[18]、GB/T 31578—2015《糧油檢驗 糧食及制品中粗蛋白測定 杜馬斯燃燒法》[19]、GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[20]測定，脂肪酸組成和相對含量的測定參照文獻[21]。

1.3.3 提取和表征油脂體相關蛋白

10 g油脂體加入至30 mL冰丙酮中，離心（5 000×g、10 min）取沉淀，按此方法用冰丙酮重復脫脂3次。沉淀物和3 倍體積氯仿-甲醇（體積比2∶1）溶液混合離心（5 000×g、10 min）取沉淀，上述步驟重復3次。最終將沉淀物冷凍干燥，即為油脂體相關蛋白。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）表征相關蛋白。

SDS-PAGE和考馬斯亮藍蛋白質染色參照Nikiforidis等[22]的方法。標準蛋白分子質量為15.0～130.0 kDa。3 mg/mL蛋白溶液與上樣緩沖液混合后，沸水浴5 min后上樣，上樣量15 μL，分離膠和濃縮膠質量分數分別為15%和5%，分離膠和濃縮膠電壓分別為80 V和120 V。凝膠經考馬斯亮藍染色液染色30 min后脫色至條帶清晰，借助凝膠成像儀進行拍照。

1.3.4 油脂體乳液ζ-電位和平均粒徑測定

利用動態光散射法通過Zetasizer Nano ZS90型粒度及電位分析儀測定滅菌前后0.05%油脂體乳液ζ-電位和平均粒徑，分散相和連續相的折射率分為1.456和1.330，測定溫度25 ℃，平衡時間120 s。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

在室溫下進行CLSM觀察，采用Ar/Kr和He/Ne雙通道激光模式，激發波長分別是488 nm和633 nm，0.1 g尼羅紅和0.01 g尼羅蘭溶于1 mL異丙醇后經0.22 μm濾膜過濾后備用。10%油脂體乳液使用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4、10 mmol/L）稀釋15 倍，1 mL樣品中加入20 μL尼羅紅染液和20 μL尼羅蘭染液，混合均勻，染色30 min后，取一滴樣品置于放載玻片上，蓋上蓋玻片并用甘油密封。放大200 倍進行觀察，對于大豆油脂體乳液采用超高分辨顯微鏡，放大63×10 倍觀察油脂體乳液分布，鏡油數值孔徑為1.42。

1.3.6 氫過氧化物值測定

氫過氧化物值（peroxide value，POV）是評價油脂體乳液在儲藏期間油脂初級氧化程度的重要指標之一。參考Hu Min等[23]的方法，為加速油脂氧化，10%新鮮油脂體乳液置于45 ℃恒溫培養箱中，測定周期14 d，每2 d取樣測定一次。將0.3 mL油脂體乳液與1.5 mL異辛烷-異丙醇（體積比2∶1）混合后，漩渦振蕩30 s，2 000×g離心2 min。取0.2 mL上清液，加2.8 mL甲醇-正丁醇（體積比2∶1）混合液，加入15 μL 3.94 mol/L的硫氰酸銨和15 μL Fe2+溶液（0.132 mol/L BaCl2和0.144 mol/L FeSO4等體積混合），避光反應20 min，以甲醇-正丁醇（體積比2∶1）混合液為對照，使用紫外分光光度計測定510 nm波長處吸光度。根據標準曲線計算POV，表示每千克油脂體乳液中所含氫過氧化物物質的量（mmol/kg）。以過氧化氫異丙苯作標準物曲線，標準曲線方程為y=0.451 1x－0.072 7，R2=0.990，其中y為吸光度，x為POV。

1.3.7 硫代巴比妥酸反應物值測定

硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值參考Zhang Haixia等[24]的方法測定。將1 mL油脂體乳液與2 mL TBARS測試液（含150 g/L三氯乙酸、3.75 g/L硫代巴比妥酸和0.25 mol/L鹽酸）混合，沸水浴30min后立即冰浴10 min。溶液過0.22 μm濾膜后，使用紫外分光光度計測定532 nm波長處的吸光度，以1,1,3,3-四乙氧基丙烷作標準物，標準曲線方程為y=0.051 1x+0.048 3，R2=0.991，其中y為吸光值，x為TBARS值。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3個平行，結果表示為平均值±標準差，采用SPSS 26.0軟件進行數據處理，采用單因素方差分析中的鄧肯檢驗對數據進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 油脂體基本組成

不同油脂體的基本組成如表1所示，在不同油脂體中，大豆油脂體蛋白質量分數和水分質量分數最高，油脂質量分數最低，這可能是由于大豆油脂體有更多的蛋白質與自由水結合[25]?？?、花生、芝麻和核桃油脂體的油脂質量分數和蛋白質量分數無顯著差異，不同油脂體水分質量分數差異可能是由于油脂體中磷脂含量不同[25]。大豆油脂體的蛋白與油脂質量分數之比（0.136）最大，而葵花（0.045）、花生（0.041）、芝麻（0.045）、核桃（0.044）油脂體的蛋白與油脂質量分數之比無明顯差異，從油脂體結構上分析，油脂體中蛋白與油脂質量分數之比越大，油脂表面有更多蛋白質，油脂體更穩定[5]。

表1 不同油脂體基本組成Table 1 Basic composition of oil bodies from various crops

2.2 不同油脂體相關蛋白組成

油脂體相關蛋白SDS-PAGE結果如圖1所示，所有油脂體蛋白均顯示出內源膜蛋白質（分子質量15～25 kDa）條帶和外源蛋白質（分子質量大于41 kDa）條帶。大豆油脂體內源膜蛋白相對分子質量為15～25 kDa，相關報道鑒定16、18、24 kDa蛋白條帶是大豆油脂體Oleosin的3種同源體[26]?？ㄓ椭w內源膜蛋白分子質量低于大豆油脂體，條帶集中分布在15～20 kDa，這與Nikiforidis等[21]的研究結果一致?；ㄉ椭w內源膜蛋白分子質量為15～20 kDa，17 kDa處條帶為花生油脂體Oleosin，97 kDa處條帶為花生脂肪氧化酶，這與Zaaboul等[14]的研究結果相似。芝麻油脂體內源膜蛋白分子質量同樣集中在15～20 kDa，15 kDa和17 kDa處條帶為芝麻Oleosin（與Jiang[27]、Lin[28]等的結果相似），20～25 kDa條帶和30～40 kDa條帶分別是芝麻11S球蛋白堿性肽鏈和酸性肽鏈，而在分子質量低于15 kDa處觀察到的蛋白質條帶是2S清蛋白。核桃油脂體Oleosin（15～20 kDa）條帶較為模糊，可能是Oleosin含量較低，核桃油脂體外源蛋白條帶更加清晰，表明核桃油脂體表面吸附較多外源蛋白。

圖1 不同油脂體相關蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) profiles of oil bodies-associated proteins from various crops

2.3 不同油脂體的脂肪酸組成及相對含量

不同油脂體脂肪酸組成和相對含量如表2所示，5種油脂體中共檢測出17種脂肪酸，脂肪酸組成上存在較大差異，其中相對含量較高的是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸，其中亞油酸和α-亞麻酸是人體必需脂肪酸，具有降血壓、降膽固醇和增強免疫力等功效[29]。不同油脂體總飽和脂肪酸相對含量從大到小依次為：花生＞大豆＞芝麻＞葵花＞核桃，其中以棕櫚酸和硬脂酸為主，占總飽和脂肪酸相對含量的90.22%～97.17%；總單不飽和脂肪酸相對含量從大到小依次為：花生＞芝麻＞葵花＞核桃＞大豆，其中以油酸為主，占總單不飽和脂肪酸相對含量的98.04%～99.29%；總多不飽和脂肪酸相對含量從大到小依次為：核桃＞大豆＞葵花＞芝麻＞花生，多不飽和脂肪酸全部來源于亞油酸和α-亞麻酸。值得注意的是，不同油脂體中花生油脂體總飽和脂肪酸相對含量（21.27%）最高。此外，核桃油脂體總不飽和脂肪酸相對含量高達90.10%，花生油脂體總不飽和脂肪酸相對含量僅為核桃油脂體的87.47%。脂肪酸的組成和相對含量與油脂氧化具有直接關系，主要是由于油脂氧化是氧氣與脂肪酸不飽和雙鍵相互作用，因此含有2個及以上雙鍵的多不飽和脂肪酸氫解離能力更低，更易失去氫原子形成自由基[30]，油脂不飽和程度越高，越易氧化，而油脂體可將油脂包裹在蛋白-磷脂膜內，防止油脂和氧氣接觸，進而抑制油脂氧化。

表2 不同油脂體脂肪酸組成及相對含量Table 2 Fatty acid composition of oil bodies from various crops

2.4 巴氏滅菌對不同植物油脂體乳液平均粒徑和ζ-電位的影響

巴氏滅菌對不同植物油脂體乳液平均粒徑影響如圖2A所示，未經滅菌的油脂體乳液平均粒徑從小到大依次為：大豆油脂體乳液＜葵花油脂體乳液＜花生油脂體乳液＜芝麻油脂體乳液＜核桃油脂體乳液，滅菌后花生油脂體乳液平均粒徑為（2.41±0.40）μm，顯著增加（P＜0.05），可能是由于加熱致使油脂體乳液液滴聚集形成大液滴，但核桃油脂體乳液平均粒徑變化與花生油脂體乳液相反，滅菌后的核桃油脂體乳液平均粒徑為（2.73±0.13）μm，顯著減?。≒＜0.05），可能是加熱導致核桃油脂體相關蛋白從油脂體表面脫落，溶液中相關蛋白的濃度增加，致使核桃油脂體乳液分散性變好[31]。大豆、葵花和芝麻油脂體乳液在滅菌后平均粒徑無顯著變化（P＞0.05），表明這些油脂體乳液具有良好的熱穩定性，加熱不會促進大豆、葵花和芝麻油脂體乳液的聚集[32]。

圖2 巴氏滅菌對不同油脂體乳液平均粒徑（A）和ζ-電位（B）的影響Fig. 2 Effect of pasteurization on average particle size (A) and ζ-potential (B) of oil body emulsions from various crops

巴氏滅菌對不同植物油脂體乳液ζ-電位的影響如圖2B所示，未經滅菌的油脂體乳液ζ-電位的絕對值從大到小依次為：核桃油脂體乳液＞花生油脂體乳液＞芝麻油脂體乳液＞大豆油脂體乳液＞葵花油脂體乳液，滅菌后的大豆油脂體乳液ζ-電位為（－22.43±1.01）mV，絕對值顯著降低（P＜0.05），大豆油脂體負電性降低可能是油脂體蛋白構象發生改變，結合負電離子能力減弱，表面電荷密度下降[33]。靜電斥力和空間位阻是維持蛋白穩定的乳液的主要作用力，表面電荷減少會導致液滴聚集。但這與圖2A中大豆油脂體粒徑無顯著變化結果相反，這可能是體系表面電荷下降對大豆油脂體粒徑影響較小。

2.5 巴氏滅菌對不同植物油脂體乳液微觀結構的影響

不同油脂體乳液的微觀結構如圖3所示，綠色代表蛋白質，紅色代表油脂。如圖3B1所示，滅菌后的大豆油脂體乳液在蛋白質聚集體的位置出現乳滴聚集，但在視野范圍內，這種聚集現象較少，大部分油脂體結構保持完整，滅菌對大豆液滴尺寸無明顯影響，這與圖2A結果一致，表明大豆油脂體膜結構穩定，巴氏滅菌不足以破壞其結構。

如圖3B3所示，滅菌后的花生油脂體乳液粒徑增加且油脂信號明顯增強，這表明乳液聚集形成大脂滴，而蛋白質的綠色信號弱于紅色信號可能是油脂滲出造成兩種信號重合。滅菌的花生油脂體乳液呈現規則的圓形，表明滅菌不會顯著影響油脂體結構蛋白，油脂體乳液的蛋白質-磷脂膜結構未被破壞，油脂體的整體結構保持完整[3]，可能是由于油脂體的Oleosin中央疏水的部位能與帶負電荷的磷脂通過鹽橋結合，加熱不能改變磷脂親水性和帶電性，但會削弱鹽橋，而當溫度降低時，削弱的鹽橋可恢復原有狀態[6]。

圖3 巴氏滅菌對不同植物油脂體乳液微觀結構的影響Fig. 3 Effect of pasteurization on micromorphology of oil body emulsions from various crops

如圖3所示，葵花油脂體乳液分布情況與其他4種油脂體乳液存在明顯差異，未滅菌的葵花油脂體乳液聚集，在水溶液中分散性較差，這可能是由于在葵花油脂體制備過程中，多次的高速離心步驟使得葵花油脂體形成難以在水溶液中分散的聚集體。滅菌的葵花油脂體乳液分散性得以改善，乳液粒徑降低，這與圖2A結果一致。圖3B2中紅色的油脂實體表明葵花油脂體乳液聚集，這種不規則的紅色油脂實體與滅菌后的核桃油脂體乳液相似（圖3B5），這可能是熱處理導致蛋白結構改變，穩定油脂體的蛋白質-磷脂膜被破壞，為減少對蛋白的需求，乳滴以共用膜的方式來穩定油脂[33]。如圖3B4、B5所示，芝麻和核桃油脂體乳液在滅菌后出現形狀不規則乳滴，表明油脂從油脂體膜內滲漏，這可能是芝麻和核桃油脂體表面膜結構蛋白含量低，滅菌處理導致油脂體膜破裂，油脂滲出[5]。滅菌后的核桃油脂體乳液粒徑減小，這與圖2A結果一致，可能是由于滅菌致使核桃油脂體乳液中的聚集體以一種更小的聚集體形式存在。

2.6 巴氏滅菌對不同油脂體乳液氧化穩定性的影響

油脂體乳液在加速氧化過程中POV和TBARS值變化規律如圖4所示，乳液初始POV和TBARS值均非常小，故而乳液初始油脂氧化可忽略。圖4A1中，對于大豆油脂體乳液，隨儲藏時間延長，未滅菌的大豆油脂體乳液POV先增加后降低，在第8天POV達到最大值（1.62±0.05）mmol/kg，而滅菌的大豆油脂體乳液第14天的POV為（0.53±0.12）mmol/kg；圖4B1中，未滅菌大豆油脂體乳液TBARS值從第8天增加速度加快，第14天TBARS值達到最大值（61.35±0.42）μmol/kg，而滅菌的大豆油脂體乳液TBARS值變化不大。說明滅菌可顯著改善大豆油脂體乳液的氧化穩定性，這可能一方面是由于滅菌致使大豆油脂體乳液表面負電荷顯著減少，油脂體表面與具有促進油脂氧化的金屬陽離子相互作用減弱，從而抑制了氧化；另一方面，熱處理可能致使大豆油脂體脂肪氧化酶活性降低，氧化脂肪能力下降[13]。

圖4 巴氏滅菌對不同油脂體乳液氧化穩定性的影響Fig. 4 Effect of pasteurization on oxidative stability of oil body emulsions from various crops

如圖4A3所示，對于花生油脂體乳液，POV隨儲藏時間延長呈先增加后將降低趨勢，在第6天未滅菌和滅菌的花生油脂體乳液POV分別為（2.30±0.04）mmol/kg和（2.20±0.01）mmol/kg；圖4B3中，TBARS值隨儲藏時間延長呈增加趨勢，在第14天未滅菌和滅菌的花生油脂體乳液TBARS值分別為（17.79±0.56）μmol/kg和（10.36±0.15）μmol/kg，說明滅菌可顯著抑制花生油脂體乳液次級氧化物的生成，這可能是由于滅菌導致花生油脂體乳液的脂肪氧化酶活性降低?；ㄉ椭w乳液TBARS值明顯低于大豆油脂體乳液，這可能是由于花生油脂體中與過氧化自由基反應的多不飽和脂肪酸濃度相對較低[30]。

如圖4A2、A4、A5所示，對于葵花、芝麻和核桃油脂體乳液，隨儲藏時間延長，POV呈先增加后降低趨勢，滅菌的葵花、芝麻和核桃油脂體乳液最大POV分別為（1.52±0.18）、（2.37±0.18）、（2.91±0.11）mmol/kg，而未滅菌的葵花、芝麻和核桃油脂體乳液最大POV分別為（0.99±0.09）、（1.00±0.03）、（2.33±0.34）mmol/kg。如圖4B2、B4、B5所示，這3種油脂體乳液TBARS值隨儲藏時間延長而增加，未滅菌的葵花、芝麻和核桃油脂體乳液在第14天TBARS值分別為（4.73±0.21）、（6.82±0.95）、（50.76±0.75）μmol/kg，滅菌后分別為（6.21±0.07）、（16.80±0.23）、（42.78±1.53）μmol/kg。結果表明巴氏滅菌會促進葵花、芝麻油脂體乳液氧化，促進核桃油脂體乳液初級氧化并延緩其次級氧化，這可能是由于這3種油脂體乳液的蛋白與油脂質量分數之比較低，乳液熱穩定性較差，滅菌破壞了油脂體的蛋白質-磷脂膜，滲出的油脂與氧氣接觸后自然氧化。

3 結 論

本實驗揭示了巴氏滅菌對不同油脂體乳液氧化穩定性的影響，為接下來油脂體乳液在沙拉醬、植物奶等產品應用提供參考。結果表明：1）大豆、葵花、花生、芝麻、核桃的油脂體基本組成、相關蛋白組成和脂肪酸組成存在較大差異，所提取的油脂體相關蛋白包含內源膜蛋白和外源蛋白；2）不同油脂體中，大豆油脂體蛋白質量分數和水分質量分數最高，油脂質量分數最少?；ㄉ椭w總飽和脂肪酸相對含量（21.27%）最高，核桃油脂體總不飽和脂肪酸相對含量（90.10%）最高；3）不同油脂體乳液經巴氏滅菌后表現出不同的理化特性：大豆、葵花和芝麻油脂體乳液經滅菌后平均粒徑無顯著變化，花生油脂體乳液經滅菌后平均粒徑增加，核桃油脂體乳液經滅菌后平均粒徑降低，滅菌后的大豆和芝麻油脂體乳液結構完整，而花生油脂體乳液聚集形成大脂滴，葵花和核桃油脂體乳液經滅菌后破乳；4）不同油脂體乳液經巴氏滅菌后表現出不同的氧化特性，巴氏滅菌可顯著改善大豆和花生油脂體乳液氧化穩定性，而對葵花、芝麻和核桃油脂體乳液起促進氧化作用。