原生態與人工添加二十二碳六烯酸羊乳制品貯藏期脂肪酸穩定性比較

朱輝權，王曉丹，蘇世燦，王建烽，逄曉陽，張書文，蘆 晶,*，呂加平,*

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2.廈門匯盛生物有限公司，福建 廈門 361000）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是人體必需的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA），對大腦健康、人體生長發育，尤其嬰兒的健康成長有至關重要的作用[1-2]。研究表明，向孕婦飲食中添加DHA會提高嬰兒的認知能力[3]，如果孕期DHA供給不足，可造成胎兒的腦細胞生長與發育不正常，導致嬰兒智力低下；嚴重缺乏DHA時還可能導致胎兒中樞神經系統控制的代謝異常[4-5]。研究發現，通過持續喂食富含DHA的配方奶粉，嬰兒在52周后視覺靈敏度顯著提高[6]。母乳中的DHA由飲食中的亞麻酸在去飽和酶的作用下合成，主要以甘油三酯的形式存在，但嬰兒體內去飽和酶的活性很低，無法滿足合成需求[7-8]，因此越來越多強化DHA的嬰幼兒配方奶粉先后在日本、美國等地問世[9]，我國對DHA在嬰幼兒食品中的添加量規定為不超過0.5%（以總脂肪酸質量計），目前DHA的允許來源有裂壺藻油、金槍魚油等[10-11]。

微藻是一種優質生物質資源，被廣泛應用于生物能源、制藥、食品、水處理、染料和飼料等領域[12]。微藻油脂中富含PUFA，其中DHA和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是最有價值的功能成分。微藻被廣泛應用于魚類和反芻動物飼料中，以生產含有較高含量ω-3脂肪酸的魚、蛋、奶和其他食物[12]，目前被應用于動物飼料成分的微藻有螺旋藻、鈍頂螺旋藻和裂壺藻[13]。

近20 年來，人們對提高反芻動物奶中不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）含量進行了大量的研究[13]。在常規飼料中添加魚油或微藻粉可以在反芻動物乳中富集UFA，且微藻比魚油富集效果更好[14]。微藻中富含的ω-3脂肪酸能有效地轉移到反芻動物乳中，研究表明，向奶牛瘤胃中注射藻油，牛乳中ω-3脂肪酸的增加量為161%[15]，而在日糧中添加微藻粉，牛乳中ω-3脂肪酸增量最高可達131%[16]，羊乳中的ω-3含量可增加32%[17]。DHA在牛乳中的增加量范圍為100%～1 000%或者更多[16-18]，在山羊乳和綿羊乳中增加量分別為100%和660%[17,19]。此外，研究發現飼喂微藻后所產牛乳的感官評分與未飼喂組無明顯區別[20]，且飼喂魚油后所產牛乳制作的巴氏殺菌乳、黃油等乳制品也無腥味[21-22]。

直接向牛奶中添加藻類油會引起一些問題。DHA含有碳碳雙鍵，不飽和程度較高，容易與氧化劑發生氧化還原反應，同時更容易受到外界因素（氧氣、溫度、光照及金屬離子等）影響，導致含量降低；雷媛媛等[23]還發現隨著乳粉中DHA添加量的增加，乳粉感官評分明顯降低，這是由于DHA添加劑本身帶有一定腥味，添加到配方乳粉中會對原本乳粉體系的滋味和氣味產生不利影響。因此，尋找一種DHA含量高的天然奶制品尤為重要。本實驗通過向奶山羊飼料中添加微藻粉獲得原生態DHA羊乳，并設立人工添加DHA組進行比較，探究DHA及其他脂肪酸在室溫和高溫環境下的貯藏穩定性，以期為制備富含DHA的天然奶制品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

嶗山奶山羊（40只）飼養于山東濰坊優佳牧場。

裂壺藻粉 廈門匯盛生物有限公司；DHA微膠囊粉（DHA質量分數不低于10%） 青島海智源生命科技有限公司。

鹽酸、硫代硫酸鈉、乙醚、異丙醇（均為分析純），正己烷（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；37種脂肪酸混合標準品 上海安普實驗科技有限公司。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發器（SHB-B95型循環水式多用真空泵+DL10-2000循環冷卻器+R-1010旋轉蒸發儀） 鄭州長城科工貿有限公司；MOILE MINORTM-2000噴霧干燥塔 德國GEA公司；中試超高溫瞬時滅菌（ultrahigh temperature instantaneous sterilization，UHT）生產線（APV1000均質機 丹麥APV公司；PT-20TS LAB TIT UHT Sterilization殺菌機 日本Powerpoint International公司；無菌填充室 上海沃迪智能裝備股份有限公司）；8890B氣相色譜儀 美國Agilent公司；AH100D高壓均質機加拿大ATS工業系統有限公司；MVS-1渦旋振蕩器 北京金北德工貿有限公司；ZDJ-4A自動電位滴定儀 上海雷磁股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制作與貯藏

1.3.1.1 奶山羊飼喂與原料奶收集

挑選胎次、產奶量等相似的嶗山奶山羊40只，將其隨機均分為空白組和實驗組，每組20只奶山羊。各組奶山羊飼喂相同的濃縮飼料及牧草，同時每天向每只實驗組奶山羊飼料中添加25 g裂壺藻粉，飼喂40 d，并使羊乳的DHA含量達到30 mg/100 g，擠奶機采集羊乳后將空白組與實驗組的羊乳于低溫（0～4 ℃）條件下冷藏，全程低溫運送至北京及時加工處理。

1.3.1.2 UHT乳的制作

在空白組原料乳中添加DHA微膠囊粉（人工添加組），使其DHA含量與實驗組（原生態組）山羊乳DHA含量相近，并對其進行均勻攪拌。將人工添加組及原生態組的山羊乳進行UHT處理：羊乳經預熱至70～80 ℃后，采用二級均質（一級均質壓力20 MPa+二級均質壓力5 MPa）處理，然后進行（127±1）℃、7 s熱處理，滅菌后的羊乳無菌冷灌裝。將制得的UHT乳分別在25 ℃和37 ℃條件下進行保存。UHT乳各項指標的測定從制樣當天開始進行，記為0 d，此后在貯藏第7、14、21、28天時進行相關指標檢測。

1.3.1.3 全脂乳粉的制作

將空白組及實驗組羊乳進行噴霧干燥處理，處理過程為：羊乳經預熱殺菌（93 ℃、3 min）后進行蒸發濃縮，待羊乳中固形物質量分數達到（45±2）%時進行均質處理（20 MPa），之后再升溫至72 ℃，進行噴霧干燥（進口溫度180 ℃、出口溫度80 ℃，壓力噴嘴霧化）后，取空白組乳粉，向其中添加DHA微膠囊粉（人工添加組），使其DHA含量與實驗組（原生態組）相近。將制得的兩組羊乳粉樣品分別在25 ℃和37 ℃條件下儲存，進行各指標的檢測，檢測取樣時間與UHT乳一致。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 脂肪酸含量的測定

參考Cruz-Hernandez等[24]的方法和GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》[25]，將31 mg十三碳酸甘油三酯放入10 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容至10 mL，作為內標液。以HCl-甲醇混合液（1∶3，V/V）為催化劑制備脂肪酸甲酯。具體步驟如下：取250 μL樣品、300 μL內標液、2 mL甲醇、2 mL HCL-甲醇混合液、1 mL正己烷加入到15 mL的旋蓋玻璃試管中，渦旋振蕩1 min。然后將試管在100 ℃的水浴中加熱1 h。冷卻至室溫后，在試管中加入2 mL水，劇烈搖晃試管30 s后再1 200×g離心5 min，取上層清液（正己烷）過0.22 μm濾膜注入到氣相色譜瓶中。

色譜條件：進樣口和檢測器的溫度均為250 ℃，載氣為氮氣，流速為0.8 mL/min，分流比為1∶20。柱溫箱升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持1 min，然后加熱到175 ℃，升溫速率為20 ℃/min，最后加熱到230 ℃后保持5 min，升溫速率為1.3 ℃/min。

使用內標法對DHA進行定量，其余脂肪酸使用面積歸一法進行相對含量的計算。

1.3.2.2 過氧化值的測定

采用GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》[26]中電位滴定法測定樣品中過氧化值（peroxide value，POV）。

1.3.2.3 酸價的測定

采用GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》[27]中冷溶劑自動電位滴定法測定樣品中酸價（acid value，AV）。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 24.0軟件對數據進行處理，結果以平均值±標準差表示；采用Excel軟件進行作圖；采用SPSS軟件通過單因素方差分析方法進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 羊乳制品貯藏期DHA含量變化

由表1和表2可見，人工添加DHA組UHT乳及全脂乳粉在不同溫度條件下貯藏0、7、14 d與21、28 d時DHA含量總體有顯著差異（P＜0.05），原生態組乳制品與人工添加組變化趨勢相似，但原生態全脂乳粉在37 ℃條件下貯藏期內無顯著性差異。貯藏第0天時原生態組UHT乳和全脂乳粉中DHA含量分別達到31.82、215.03 mg/100 g。同時，隨著貯藏時間的延長，人工添加與原生態組乳制品DHA含量均降低，但原生態組的DHA含量下降速率明顯低于人工添加組，與室溫（25 ℃）貯藏條件相比，高溫（37 ℃）下各組乳制品中DHA含量降低更明顯，這表明溫度會加速DHA的氧化速率。DHA是一種PUFA，極易受到外界因素（如氧氣、光照、溫度及金屬離子）的影響而發生氧化反應，造成DHA含量的下降[28]。

表1 UHT乳貯藏期DHA含量變化Table 1 Changes in content of DHA in UHT-sterilized goat milk during storage mg/100 g

表2 全脂乳粉貯藏期DHA含量變化Table 2 Changes in content of DHA in goat milk powder during storage mg/100 g

由圖1可見，在UHT乳中，人工添加組和原生態組DHA含量的降低率在第28天時均可達到30%以上，其中37 ℃下人工添加組UHT乳DHA含量降低率（與0 d相比，下同）最高，為（40.92±3.52）%，原生態組UHT乳DHA含量降低率為（36.70±4.84）%；同時，在37 ℃條件下貯藏第14天時，原生態組DHA含量降低率最高，而貯藏14 d后，原生態組降低速率減緩，人工添加組降低速率增加，這說明與人工添加組相比，在貯藏前期原生態組中DHA更容易受到高溫條件的影響，但隨貯藏時間的延長，DHA含量降低速率會低于人工添加組，這可能是由于前期人工添加組DHA受到微膠囊保護氧化速率較慢，隨著貯存時間的延長，包埋壁材被破壞，DHA暴露于空氣中，加速了氧化。相比于UHT乳，貯藏前期全脂乳粉人工添加組與原生態組DHA降低率均較低，在常溫（25 ℃）貯藏第14天時，人工添加組與原生態組DHA含量降低率分別為6.64%和5.55%。而在14 d后，人工添加組與原生態組DHA含量降低率呈現急劇上升趨勢，在貯藏結束時（第28天），人工添加組和原生態組在37 ℃條件下的DHA含量降低率則分別為36.37%和29.34%，DHA含量降低率小于UHT乳。張鵬等[1]選擇不同添加量的DHA含量嬰幼兒配方奶粉進行為期48 d的貯藏實驗，結果顯示樣品中DHA含量降低速率隨貯藏時間的延長有所變化，最高可達14.3%；李佳梅等[29]發現45 ℃條件下貯藏6個月后嬰幼兒配方奶粉中DHA含量的降低率僅為1.94%，本實驗中人工添加組全脂羊乳粉在37 ℃下貯藏28 d后，DHA含量的降低率為36.37%，這與之前文獻報道有所不同，可能與所選的外添加粉DHA包埋方式及乳原料品種及用量不同有關。

圖1 UHT乳及全脂乳粉中DHA含量降低率Fig. 1 Change in percentage decrease of DHA content in UHT-sterilized goat milk and milk powder during storage

2.2 羊乳制品脂肪酸貯藏穩定性分析結果

由表3和表5可知，貯藏時間及貯藏溫度對人工添加DHA的全脂乳粉及UHT乳的脂肪酸相對含量均有明顯影響。在貯藏期間，人工添加DHA的UHT乳中中短鏈飽和脂肪酸如丁酸（C4:0）、己酸（C6:0）、辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）相對含量在所有溫度下基本均呈現先增加后降低再增加，而全脂乳粉中的中短鏈飽和脂肪酸相對含量呈現先降低后增加的趨勢。人工添加DHA的UHT乳中長鏈不飽和脂肪酸如十五碳烯酸（C15:1）、十六碳烯酸（C16:1）在所有溫度下相對含量均增加，且在高溫下增加速率更高，油酸（C18:1n9c）含量則一直降低。人工添加DHA的全脂乳粉中十四碳烯酸（C14:1）、十六碳烯酸（C16:1）、油酸（C18:1n9c）的相對含量則呈現降低趨勢。棕櫚酸（C16:0）、十七烷酸（C17:0）在人工添加DHA的UHT乳和全脂乳粉中相對含量保持穩定。牛乳中的脂質在貯藏期間會發生自動氧化，其中不飽和脂肪酸自動氧化加氫斷裂形成飽和脂肪酸及更短的脂肪酸[30]，在人工添加DHA的UHT乳及全脂乳粉中，隨貯藏期的延長，不同脂肪酸表現出不一樣的變化規律，中短鏈飽和脂肪酸相對含量整體增加，UHT乳中長鏈不飽和脂肪酸相對含量增加，全脂乳粉中長鏈不飽和脂肪酸相對含量則降低。

由表4和表6可見，貯藏時間及貯藏溫度對原生態DHA組全脂乳粉及UHT乳的脂肪酸含量有明顯影響。隨貯藏時間的延長，原生態DHA組UHT乳中飽和脂肪酸如C4:0、C6:0相對含量上升，而在全脂乳粉中，C4:0、C6:0相對含量減少。此外，原生態DHA組UHT乳和全脂乳粉中C8:0和C10:0相對含量在貯藏期間呈基本穩定狀態。這可能是由于全脂乳粉中C4:0、C6:0進一步氧化生成碳鏈更短的脂肪酸如乙酸、丙酸等。原生態DHA組UHT乳中不飽和脂肪酸C15:1相對含量增加，C16:1、C18:2n6c相對含量減少，C18:3n3相對含量保持穩定。全脂乳粉中C14:1、C15:1、C18:1n9c、C18:2n6c相對含量均降低。長鏈飽和脂肪酸C16:0相對含量在UHT乳和全脂乳粉中含量均保持穩定。與人工添加組相比，原生態DHA乳制品的PUFA含量降低速率會更高，這可能是由于飼喂微藻會增加羊乳中PUFA的含量[17]，因此原生態羊乳制品中在貯藏開始時（第0天）PUFA含量就明顯高于人工添加組，而PUFA在貯藏過程中會受到空氣、光照水分等因素的影響被氧化成碳鏈更短的脂肪酸，進而導致PUFA相對含量降低。

表3 人工添加組UHT乳貯藏期脂肪酸相對含量變化Table 3 Changes in fatty acid contents in UHT-sterilized milk artificially added with DHA during storage %

續表3 %

表4 原生態組UHT乳貯藏期脂肪酸相對含量變化Table 4 Changes in fatty acid contents in UHT-sterilized milk naturally enriched with DHA during storage %

續表4 %

表5 人工添加DHA全脂乳粉貯藏期脂肪酸相對含量變化Table 5 Changes in fatty acid contents in milk powder artificially added with DHA during storage %

續表5 %

表6 原生態DHA全脂乳粉貯藏期脂肪酸相對含量變化Table 6 Changes in fatty acid contents of milk powder naturally rich in DHA during storage %

續表6 %

2.3 羊乳制品貯藏期POV及AV的變化規律

POV和AV是衡量貯藏期食品中油脂氧化程度的重要指標。由圖2可知，各組UHT乳及全脂乳粉在常溫（25 ℃）及高溫條件（37 ℃）下POV總體均呈現上升趨勢，且高溫會加速乳制品POV的升高。UHT乳中人工添加組在37 ℃條件貯藏末期POV可達8.35 meq/kg，同期原生態組中POV為3.71 meq/kg；與UHT乳相比，乳粉POV上升趨勢較緩，且原生態組乳粉在25 ℃貯藏期內無明顯變化，說明與人工添加DHA乳制品相比，原生態DHA乳制品抗氧化能力更強。乳制品在貯藏期間脂質會發生自動氧化產生過氧化物[30]，引起POV升高，同時，高溫會加速脂肪的共價鍵發生斷裂，生成自由基，引起脂肪的氧化，因而降低貯藏溫度可減緩脂質的氧化速度[31]。

圖2 UHT乳及全脂乳粉貯藏期POV的變化Fig. 2 Variation in POV of UHT-sterilized milk and milk powder during storage

由圖3可知，UHT乳及全脂乳粉貯藏期間AV均上升，說明貯藏期間樣品中脂肪發生了一定程度的水解。37 ℃下人工添加DHA組UHT乳與其他組相比，AV上升明顯，且在第21天后急速增加，在貯藏第28天時達到最高（4.48 mg/g）；與UHT乳相比，全脂乳粉AV則相對上升緩慢，這可能是與全脂乳粉中水分活度低有關。同時，與POV相似，原生態組AV上升速率較人工添加組緩慢，在37 ℃貯藏28 d時，人工添加組UHT乳和全脂乳粉中AV分別可達原生態組的503%和142%。此外，對于全脂乳粉來說，在貯藏第28天時，原生態DHA組全脂乳粉在高溫條件下POV和AV分別為1.16 meq/kg和1.11 mg/g，此時人工添加DHA組全脂乳粉中POV和AV分別是原生態組的179%和142%。Celestino等[32]研究發現，鮮乳中含有微生物產生的耐熱性脂肪酶，這些酶可耐受高溫而殘留在乳粉中，在貯藏過程中可分解乳脂中的甘油三酯，生成游離脂肪酸和甘油等物質，造成全脂羊乳粉脂肪AV上升，而高溫可加速水解反應，游離脂肪酸生成積累速度加快，AV上升速度較快，同時游離脂肪酸含量的增加對全脂羊乳粉脂肪的氧化有一定的促進作用。

圖3 UHT乳及全脂乳粉貯藏期AV的變化Fig. 3 Variation in AV of UHT-sterilized milk and milk powder during storage

3 結 論

本研究通過向奶山羊飼料中添加DHA微藻粉獲得天然原生態DHA羊乳，將其制作成UHT乳及全脂乳粉，同時設立人工添加DHA微膠囊粉的UHT乳及全脂乳粉作為對照組，在常溫（25 ℃）與高溫（37 ℃）下進行為期28 d的貯藏實驗，并進行相關指標的檢測。結果表明，隨貯藏時間的延長，原生態組UHT乳和全脂乳粉中的DHA含量降低率低于人工添加組，且在貯藏前期，原生態組UHT乳中DHA含量更易受到高溫影響。POV和AV是評定貯藏期油脂氧化程度的重要指標，在貯藏期間，原生態DHA組UHT乳及全脂乳粉POV和AV上升速率明顯低于人工添加DHA組，在貯藏第28天時，原生態DHA組全脂乳粉在高溫條件下POV和AV分別為1.16 meq/kg和1.11 mg/g，此時人工添加DHA組全脂乳粉中POV和AV分別是原生態的179%和142%。通過UHT乳和全脂乳粉貯藏期間脂肪酸含量變化研究可知，原生態與人工添加DHA的UHT乳和全脂乳粉中PUFA含量下降，且與人工添加DHA的全脂乳粉相比，原生態組乳制品中多不飽和脂肪酸含量更高，更易氧化生成碳鏈更短的脂肪酸，這與脂肪酸的自動氧化緊密相關。