超聲處理對麥醇溶蛋白/蘆丁相互作用及結構特性的影響

薛艾蓮，李春翼，王啟明，張 馳，雷小娟,2，趙吉春,2，曾凱芳,2，明 建,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

麥醇溶蛋白（gliadin，G）作為生物聚合物的一種，其因富含脯氨酸也常被稱為來自小麥籽粒的脯氨酸，其為單體單鏈多肽，分子質量范圍為28～70 kDa，其具有自組裝能力[1]。將麥醇溶蛋白與其他生物聚合物絡合或進行表面改性，可以調節其潤濕性以改善功能特性。蛋白質的物理化學性質（如表面疏水性、游離巰基含量、Zeta電位等）可以通過與多酚形成非共價配合物或共價結合來改善[2]。酚類化合物廣泛存在于水果和蔬菜中，它們具有良好的抗氧化功能，通常被加入到食品基質以改善其穩定性[3]。蘆?。╮utin，R）具有優異的抗菌性和抗氧化性，對人體健康有益。蘆丁在水溶液中以不溶性顆粒的形式存在。研究表明，富含脯氨酸的麥醇溶蛋白與蘆丁具有強烈的相互作用，主要作用力為氫鍵和范德華力，蘆丁與麥醇溶蛋白的結合能力大于槲皮素、異槲皮素、對香豆酸、咖啡酸以及阿魏酸與麥醇溶蛋白的結合能力[4]。

在食品加工、儲存、烹飪和食用過程中，蛋白質的功能特性會影響蛋白質在食品體系的物理和化學性質，同時蛋白質的功能特性受多種因素影響，如pH值、干燥、加熱、離子強度、儲存條件、還原劑的存在以及物理改性[5]。在蛋白質修飾的不同物理方法中，超聲處理具有操作簡單、節能、環保的優勢[6]。超聲效果一般受壓力、溫度、強度和頻率的影響，根據頻率范圍可分為高能超聲波和低能超聲波。高能超聲波中使用的高頻率（20～100 kHz）會導致空化現象，進而產生的高壓（90.91 MPa）和高溫（4 726.85 ℃），從而使蛋白質物理化學性質發生改變[7]。近年來，許多研究發現，超聲處理對動植物蛋白質特別是大豆蛋白的起泡性、溶解性、乳化性和其他功能特性具有較大的影響[8-9]。Pan Jinfeng等[10]研究發現超聲處理改變了沒食子酸對魚肌原纖維蛋白的作用方式，超聲波促進了魚肌原纖維蛋白的結構展開及其反應基團的暴露，通過觸發OH·與沒食子酸的作用進而產生沒食子酸醌，導致了魚肌原纖維蛋白凝膠特性的變化。目前大量的研究集中于超聲改變蛋白結構及功能性質方面[8-9,11]。有關超聲影響蛋白與多酚相互作用的研究相對較少。

因此，本研究通過反溶劑法制備麥醇溶蛋白-蘆丁的復合物，旨在評估超聲處理下麥醇溶蛋白-蘆丁相互作用及其復合物功能特性的變化。旨在通過超聲聯合蘆丁增強麥醇溶蛋白的功能特性，以拓寬麥醇溶蛋白的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥醇溶蛋白 美國Sigma公司；蘆丁 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ZEN3690激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松原華興科技有限公司；SCIENTZ-F1500超聲波分散儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；MCR302流變儀 奧地利安東帕公司；DXR2激光拉曼光譜儀 美國Thermo Fisher公司；BX53熒光正置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；Phenom Pro掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 荷蘭Phenom Pro公司；LSM800激光共聚焦顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 醇溶蛋白-蘆丁復合物的制備

采用反溶劑法制備麥醇溶蛋白-蘆?。╣liadin-rutin，G-R）分散液，具體操作參考Filippidi等[12]的方法略作修改。在磁力攪拌下將0.10 g麥醇溶蛋白和0.01 g蘆丁分別溶解于50 mL 10 mmol/L乙酸溶液、50 mL體積分數60%乙醇溶液中，在4 ℃下儲存過夜以完全水合，然后等體積混勻（V（水相）∶V（醇相）=3∶1）。將100 mL G-R溶液逐滴加入300 mL純水中，邊加邊均質（10 000 r/min、4 min）。均質完成后，將超聲探頭置于距離所得溶液底部1 cm的位置，分別設置超聲功率為150、300、450、600 W，超聲時間20 min，燒杯置于冰水浴中。經上述步驟后的樣液一部分留樣用作部分指標測定，另一部分于45 ℃水浴下旋轉蒸發后凍干，得到固體樣進行相關指標測定。在相同條件處理下，未添加蘆丁的麥醇溶蛋白溶液為對照（即等體積混勻時，溶液中沒有蘆?。?。

1.3.2 表面疏水性測定

表面疏水性參考文獻[13]的方法測定。吸取1 mL樣品于離心管中，加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍，漩渦混勻后在8 000 r/min轉速下離心10 min，將所得上清液用去離子水稀釋10 倍后于595 nm波長處測定吸光度（A）。以溴酚藍結合量表征表面疏水性，具體按公式（1）計算。

1.3.3 游離巰基含量測定

參照Wu Li等[14]的方法略作修改。在1 mL樣品溶液中加入4 mL Tris-Gly緩沖液、0.05 mL Ellman試劑（含2 mmol/L 2-硝基苯甲酸和50 mmol/L乙酸鈉），將混合溶液在室溫下孵育20 min，然后在412 nm波長處測定吸光度。游離巰基含量按公式（2）計算。

式中：A表示除去試劑空白后樣品的吸光度；D表示稀釋倍數；ρ表示樣品中的蛋白質量濃度（mg/mL）。

1.3.4 二級結構測定

參照文獻[15-16]的方法，通過拉曼光譜的酰胺I帶分析蛋白質的二級結構，拉曼光譜測定條件：將凍干后的樣品置于玻璃載玻片上，用激光拉曼顯微鏡在785 nm的激發波長下進行實驗。實驗參數為：顯微鏡物鏡為20 倍，光斑尺寸為1 μm，狹縫寬度為50 μm，激光能量為15 mW，背景曝光時間為4.2 s，曝光次數為38，背景曝光次數為512，光柵為400 刻度/nm，掃描范圍為500～4 000 cm－1。使用OMNIC 8.2軟件進行光譜基線校正，平滑和原始數據歸一化處理（以苯丙氨酸（1 003 cm-1）為內標進行歸一化處理）。使用Peakfit 4.12軟件進行分峰擬合，各二級結構對應的波長范圍分別為：α-螺旋（1 645～1 660 cm－1）、β-折疊（16 70～1 680 cm－1）、β-轉角（1 640～1 645 cm－1、1 680～1 690 cm－1）、無規卷曲（1 660～1 665 cm－1）。

1.3.5 內源熒光光譜測定

吸取1 mL處理好的樣液于比色皿中，使用熒光分光光度計測定內源熒光光譜。實驗條件：激發波長λex=282 nm、發射波長范圍300～500 nm、電壓400 V、激發狹縫與發射狹縫均為5.0 nm。

1.3.6 同步熒光光譜測定

使用熒光分光光度計測定同步熒光光譜。固定激發波長為282 nm，在250～500 nm發射波長范圍內掃描樣品，在25 ℃下進行同步熒光強度測定。設置波長差Δλ=15 nm和Δλ=60 nm（Δλ=最大激發波長－最大發射波長），狹縫寬度為5.0 nm，掃描速度為1 500 nm/min。

1.3.7 紫外掃描光譜測定

參考王麗穎[4]的方法略作修改。以去離子水為空白對照，依次移取3 mL處理好的樣液于比色皿樣品池中。采用UV-2450分光光度計測定樣品在190～400 nm范圍內的紫外吸收光譜。

1.3.8 SEM觀察

參考Liu Rui等[17]的方法略作修改。取適量真空冷凍干燥后的麥醇溶蛋白-蘆丁復合物干燥粉末樣品，經噴金處理后在10 kV加速電壓下掃描，觀察樣品的微觀結構。放大倍數8 000 倍。

1.3.9 差示掃描量熱法測定熱特性

采用差示掃描量熱儀對凍干后樣品的熱特性進行分析。質量為2.00 mg的樣品被放置在鋁鍋內，并用鋁蓋緊密密封，以10℃/min的恒定速率從40 ℃加熱到100 ℃，以空白的鋁鍋作為參照。利用Origin 9.0軟件計算峰值溫度。

1.4 數據統計及分析

每組實驗3次重復，利用Origin 9.0軟件處理數據與作圖。使用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析，具體采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 超聲處理對G、G-R復合物表面疏水性的影響

表面疏水性可用來表征蛋白質分子表面存在的疏水基團數目[18]，可用于評價蛋白質的理化和結構性質。溴酚藍能與蛋白質中的疏水位點結合，因此可以用溴酚藍結合量表征蛋白質的表面疏水性。如表1所示，不同超聲功率條件下G-R復合物的表面疏水性均高于G，是因為酚類化合物能夠誘導蛋白質的構象變化和去折疊，暴露出疏水性氨基酸[19]。隨著超聲功率的增加，G-R復合物的表面疏水性整體上呈現上升趨勢，是因為超聲波可以破壞蛋白質分子之間的氫鍵、靜電相互作用和水合作用，使埋在分子內部的疏水基團暴露出來[20]。G-R復合物在超聲處理后表面疏水性增加，蘆丁的添加與超聲處理可能協同促進麥醇溶蛋白的去折疊，暴露出更多的疏水基團。這一研究結果與Yang Xue等[21]的研究結果一致。超聲功率為450 W時，G的表面疏水性有所下降，一方面可能是因為疏水性驅動蛋白質聚集，使暴露的疏水基團被包裹在蛋白質中[19]；另一方面可能是因為高功率的超聲誘導蛋白質發生變性，導致蛋白聚集體的形成，從而降低了表面疏水性。超聲功率達到600 W時，G的表面疏水性呈現上升趨勢，但無顯著性變化。過高的超聲功率產生的空化和機械效應促使疏水性基團進一步暴露[20]?？偟膩碚f，表面疏水性的增加可以通過湍流、剪切力和微流化效應來解釋，這些效應是由超聲過程中不同的空化水平引起的，這導致蛋白質結構的變化，暴露了分子內部最初的疏水基團和區域。

表1 超聲處理后G、G-R復合物的表面疏水性與游離巰基含量Table 1 Surface hydrophobicity and free sulfhydryl content of gliadin and its complex with rutin after ultrasonic treatment

2.2 超聲處理對G、G-R復合物游離巰基含量的影響

游離巰基是影響蛋白質性能的重要活性基團。如表1所示，與蘆丁復合后，G的游離巰基含量提高，可能歸因于蘆丁作為抗氧化劑具有保護作用。與未超聲相比，在150～600 W下超聲后的G游離巰基含量下降，可能是因為超聲波可以產生OH·，它可以促進蛋白質二硫鍵的形成，從而加劇了游離巰基的損失[10]。在實驗的4種超聲功率下，超聲功率為450 W時G的游離巰基含量最高，而研究發現，超聲可以降低蛋白質的粒徑，使更多的內部巰基暴露在分子表面[22]，因此G的游離巰基含量升高可能與超聲導致的粒徑降低有關。較低功率（150、300 W）的超聲處理對G-R的游離巰基含量無顯著影響。此外，較高功率（450 W）超聲使得蘆丁對·OH的清除能力增強，從而減少游離巰基的損失，因此450 W處理組的游離巰基含量高于300 W處理組。以上結果表明超聲處理對G及G-R中游離巰基的作用受超聲功率的影響。

2.3 超聲處理對G、G-R復合物二級結構含量的影響

α-螺旋主要是由羰基氧（C=O）和亞氨基氫（—NH—）之間的分子內氫鍵穩定的；β-折疊是由多肽鏈間的氫鍵穩定的；β-轉角結構是伸展的肽鏈形成180°的U型回折；無規卷曲則為未折疊的構象，其與蛋白質的柔韌性有關[23]。因此，二級結構的變化容易受到氫鍵的影響。之前的研究表明無規卷曲作為蛋白質中存在的一種靈活的開放結構，在蛋白質和表沒食子兒茶素沒食子酸酯的結合過程中發揮了重要作用[24]。如圖1所示，未經超聲處理G的二級結構相對含量分別為：α-螺旋38.86%、β-折疊25.49%、β-轉角20.22%、無規卷曲15.43%；與G相比，G-R復合物的α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲相對含量分別下降13.77%、3.64%、－22.23%、4.82%。如圖1A所示，超聲處理后G的β-折疊、β-轉角與無規卷曲相對含量上升，α-螺旋相對含量下降。如圖1B所示，G-R復合物在超聲條件下α-螺旋、無規卷曲相對含量增加，β-轉角相對含量減少，β-折疊在超聲功率低于600 W時，含量減少，功率達到600 W時，其含量增加。這一現象是由于在超聲過程中產生的強烈的剪切、湍流和空化力，破壞了局部氨基酸序列和分子不同部分之間的相互作用，促進了蛋白質分子的結構轉變[25]。

圖1 不同超聲條件下G和G-R復合物的二級結構相對含量Fig. 1 Relative content of secondary structures of gliadin and its rutin complex under different ultrasonic conditions

2.4 超聲處理對G、G-R復合物內源熒光光譜的影響

內源熒光光譜技術是一種通過記錄從激發態到基態的分子躍遷來分析配體和蛋白質之間絡合作用的分析方法。在蛋白質的內部存在色氨酸，當激發波長為280 nm時，色氨酸被激發產生熒光，熒光強度減弱，說明蛋白內部暴露的色氨酸殘基減少，蛋白發生了熒光猝滅[26]。如圖2所示，所有樣品的最大熒光發射波長（λmax）均在340 nm波長附近被觀察到。蘆丁誘導的麥醇溶蛋白結構變化主要是由非共價力引起的，例如蘆丁芳香環與芳香氨基酸殘基之間的疏水相互作用等[27]。麥醇溶蛋白中加入蘆丁后發生了明顯的熒光猝滅現象，可能是蘆丁與麥醇溶蛋白發生相互作用改變了蛋白的空間構象，使色氨酸殘基周圍環境的疏水性增強，色氨酸可能處于更加包埋的狀態。超聲處理后G、G-R復合物的色氨酸熒光強度均明顯降低，可能是超聲波促進了分子結構的展開并破壞了疏水相互作用，從而將色氨酸殘基轉移到更疏水的環境中。當超聲功率為600 W時，G、G-R復合物在最大熒光發射波長處的熒光強度較450 W時有所增加，可能是超聲作用使得色氨酸殘基暴露，破壞了蛋白質分子相互作用[28]。隨著超聲功率的增加，樣品的波長紅移可能是由于蛋白質-配體相互作用使色氨酸殘基暴露在親水環境中，色氨酸殘基離蛋白分子表面更近。

圖2 不同超聲條件下G和G-R復合物的內源熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of gliadin and rutin under different ultrasonic conditions

2.5 超聲處理對G、G-R復合物同步熒光光譜的影響

同步熒光光譜技術用于研究配體對蛋白質構象的影響時，它可以通過最大發射波長和此處的熒光強度的變化，提供氨基酸殘基周圍環境變化的信息[26]。氨基酸殘基周圍環境的極性可能影響該氨基酸殘基的最大發射峰位置。如圖3所示，加入蘆丁后蛋白質熒光強度均降低，表明酪氨酸和色氨酸均參與了蘆丁與麥醇溶蛋白間的相互作用。色氨酸殘基（Δλ=60 nm）的熒光強度比酪氨酸殘基（Δλ=15 nm）的熒光強度弱，即色氨酸殘基對固有熒光的猝滅貢獻更大。當超聲功率從0 W增加到150 W時，G的內源熒光光譜發生較大的藍移（284.5 nm→282.5 nm），表明超聲處理使色氨酸殘基周圍環境的疏水性增強，極性減小，色氨酸可能處于較少暴露的狀態。經超聲處理后G-R的最大發射波長均未發生明顯的變化，這一現象表明，經超聲處理后，在蘆丁與氨基酸殘基結合的過程中，酪氨酸和色氨酸殘基周圍環境的極性保持不變。

圖3 不同超聲條件下G和G-R復合物的同步熒光光譜Fig. 3 Synchronous fluorescence spectra of gliadin and its complex with rutin under different ultrasonic conditions

2.6 超聲處理對G、G-R復合物紫外掃描光譜的影響

紫外光譜可以反映相互作用后的蛋白結構變化，主要是色氨酸和酪氨酸殘基所處的微環境變化。苯丙氨酸（Phe）在278 nm波長處的紫外吸收強度主要受酪氨酸和色氨酸殘基周圍微環境變化的影響[29]。如圖4所示，與R復合后，G-R的紫外吸收強度增加，278 nm處的吸收峰左移（藍移），表明蘆丁的加入引起了蛋白構象變化，氨基酸殘基的微環境發生變化。隨著超聲功率的增大，G-R的紫外吸收強度呈現先升高后降低的趨勢。紫外吸收強度的增加可能是由于超聲空化效應破壞了相鄰蛋白質分子間的相互作用，酪氨酸和色氨酸殘基所處的微環境發生變化，引起了紫外吸收強度的變化[30-31]。當超聲功率為300 W和450 W時，G和G-R的紫外吸收強度均高于其他超聲功率組的樣品。因此，適當的超聲功率處理有利于麥醇溶蛋白分子結構的展開，暴露出更多苯丙氨酸殘基，使得紫外吸收強度增加。

圖4 不同超聲條件下G和G-R復合物的紫外掃描光譜Fig. 4 UV-Vis spectra of gliadin and its rutin complex under different ultrasonic conditions

2.7 超聲處理對G、G-R復合物微觀結構的影響

如圖5所示，未經超聲處理的G呈現出許多不規則的片狀結構、小間隙和大聚集體，表明麥醇溶蛋白不穩定，其往往通過疏水作用和氫鍵形成復雜結構[32]。經超聲處理后，G以致密有序的結構存在，空隙增多，這可能是由于超聲處理引起了微射流、剪切力、沖擊波和湍流，破壞了多肽鏈中氫鍵和范德華力相互作用以及蛋白質分子之間的交聯，引起了麥醇溶蛋白的膨脹和其空間構象、二級結構的其他變化[32-33]。G-R復合物的孔徑較G變得小而均勻，并且樣品的紋理更加松散。所有樣品經超聲處理后均呈現均勻松散的蜂窩狀結構。本文研究與Yang Xue等[21]的研究結果相似，即適當的超聲處理會使大米蛋白質的組織結構變得松散。

圖5 不同超聲條件下G和G-R復合物的SEM圖Fig. 5 Scanning electron microscopic images of gliadin and its rutin complex after ultrasonic treatments

2.8 超聲處理對G、G-R復合物熱穩定性的影響

熱變性溫度與熱穩定性密切相關。如圖6所示，未經超聲處理時，G-R的熱變性溫度高于G，表明加入R后，G-R復合物的熱穩定性更好。經超聲處理后，G與G-R的熱變性溫度均升高，表明超聲處理可以提高G與G-R復合物的熱穩定性。這與Qu Wenjuan等[34]的研究結果一致，其研究發現超聲處理可以使菜籽分離蛋白與葡聚糖共軛物的二級結構變得更加穩定，從而改善共軛物的熱穩定性。此外，研究表明超聲波可以提供極瞬時的高溫和高壓，進一步加速肽鍵運動，增加多酚與蛋白質氨基的碰撞頻率，增強多酚與蛋白質的相互作用[35]。因此經超聲處理后，當超聲功率為150、300 W和450 W時，G-R復合物的熱變性溫度均高于G。

圖6 不同超聲條件下G和G-R復合物的差示掃描量熱圖Fig. 6 Differential scanning calorimetry thermograms of gliadin and its rutin complex under different ultrasonic conditions

3 結 論

超聲處理能對麥醇溶蛋白以及蛋白與蘆丁的復合物結構產生影響。超聲處理后，G-R復合物的表面疏水性均高于G。加入蘆丁后，G-R的游離巰基含量增加，當超聲功率為450 W時，G和G-R的游離巰基含量均大于其他超聲功率組的樣品。超聲處理還能影響G和G-R的二級結構含量。內源熒光光譜結果表明，超聲處理后G、G-R復合物的色氨酸熒光強度均明顯降低。經超聲處理后，在蘆丁與氨基酸殘基結合的過程中，酪氨酸和色氨酸殘基周圍環境的極性保持不變。此外，SEM與差示掃描量熱分析發現，超聲處理可以改變G-R的微觀結構，促進疏松多孔結構的出現，還可以提高復合物的熱穩定性。綜上，超聲波對麥醇溶蛋白與蘆丁的相互作用有顯著影響，該結論為揭示麥醇溶蛋白-蘆丁的相互作用機理提供了理論依據，對開拓麥醇溶蛋白的市場潛力、提高麥醇溶蛋白的應用前景具有積極意義。