兩種富硒黃牛肝菌傘多糖的制備、表征及其抗氧化活性

劉韞滔，李林鍵，李 誠，李 琴，曾 珍，劉愛平，李小林，唐自鐘，紀昌聯

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川省食用菌研究所，四川 成都 610066；3.四川農業大學生命科學學院，四川 雅安 625014；4.成都雅樂鮮生物科技有限公司，四川 成都 610400）

硒（Se）是人體所必需的一種微量元素，按化學形態主要分為無機硒和有機硒，無機硒主要指硒酸鈉、亞硒酸鈉和二氧化硒，而有機硒一般以硒蛋白和硒氨基酸等形式存在[1]。大量研究發現硒元素具有抗氧化、降血糖、抗癌、抑菌等多種生物活性[2-3]，若機體缺硒則會引發大骨節病、心血管疾病和癌癥等多種疾病[4]，所以合理地補充硒元素可以增強人體免疫力，從而有效預防甚至治療這些疾病。但是由于硒元素的推薦攝入量與可耐受最高攝入量非常接近，極易導致硒中毒，從而限制了其在膳食補充劑中的進一步應用。因此，研究開發高效低毒的富硒制劑意義重大。

硒多糖是一類由硒和多糖共價結合而形成的功能性多糖，與無機硒相比，硒多糖具有毒性低、副作用小、生物利用度高等優點[5]，更易被機體吸收利用。有研究報道，通過亞硒酸酯化修飾獲得的硒多糖[6-8]不但保留了多糖的基本結構和生物功能，而且使其更容易被吸收利用，提高了硒元素的生物利用度，從而表現出比硒元素和多糖本身更高的抗氧化、降血糖和免疫調節活性。例如，Feng Haibo等[9]制備的川明參硒化多糖可以促進脾細胞增殖，增加T淋巴細胞的活性，顯著提高免疫活性。納米硒是一種紅色膠體狀態的單質硒，與硒酸鹽和亞硒酸鹽化合物相比，納米硒具有更高的生物活性、安全性以及生物相容性，納米硒的功能活性通常具有尺寸效應，即粒徑越小，活性越高。但是化學合成的納米硒并不穩定，在水溶液中極易發生聚集或轉化為其他不活躍的形式，從而影響其生物活性[10-13]。因此，為提高納米硒的穩定性，近年來，多種多糖已被廣泛用于修飾還原反應中最初形成的納米硒粒子。

牛肝菌是牛肝菌科的大型野生藥食兩用真菌，其肉質肥美、營養豐富，被譽為“四大名菌”之一，含有多糖、多酚等活性物質，具有較好的抗氧化功能。主要分為白、紅、黃、黑牛肝菌和美味牛肝菌[14-15]。其中黃牛肝菌（Suillellus luridus）主要分布在我國云南和四川兩省，不僅富含蛋白質、碳水化合物、礦物質等營養物質，同時含有多種活性成分。本課題組前期研究發現，黃牛肝菌傘多糖（polysaccharides fromSuillellus luridus，SLPC）表現出較好的抗氧化、抗糖尿病等生理活性[16]。如果能將具有強抗氧化活性的SLPC與硒元素結合，很可能會顯著提高多糖和硒單獨表現出來的生物活性。然而目前鮮見關于這方面的研究報道，因此一方面可以通過亞硒酸酯化修飾SLPC制備硒多糖，降低硒的毒性和副作用，提高多糖的生物活性；另一方面SLPC也可作為分散劑，對納米硒進行表面修飾，制備納米硒-多糖復合物，提高硒納米粒子穩定性的同時增加其生物活性，從而為富硒產品的開發提供新思路。

本研究以SLPC為原料，采用HNO3-Na2SeO3法進行亞硒酸酯化修飾制備硒化多糖（selenide polysaccharides fromSuillellus luridus，Se-SLPC），利用高效液相色譜、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振等對Se-SLPC的理化性質和結構特性進行表征；以SLPC為分散劑，以VC還原亞硒酸鈉制備納米硒-多糖復合物（nano-seleniumpolysaccharides fromSuillellus luridus，SLPC-SeNPs），通過納米粒度儀和透射電子顯微鏡對SLPC-SeNPs的粒徑和表面形貌進行表征。此外，評價Se-SLPC和SLPCSeNPs的體外抗氧化活性，探討多糖結構和生物活性之間的構效關系，旨在為黃牛肝菌資源開發提供理論參考，也為研發安全高效的補硒制劑提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃牛肝菌子實體采自于四川省。選取黃色（包括褐黃色、橘黃色、暗黃色等）、傘形完整無外傷的菌株，加冰袋運至四川農業大學食品學院。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；亞硒酸鈉（分析純） 山東西亞化學工業有限公司；抗壞血酸（分析純） 上海?？瞪锛夹g有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

NICOLET IS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛儀器有限公司；Nano-Zs90納米粒度儀 英國Malvern公司；Libra 200FE透射電子顯微鏡 德國卡爾蔡司股份公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；DSA100-GL1超聲波清洗機 福州德森精工有限公司；AB1104-N電子分析天平、DELTA320 pH計瑞士Mettler Toledo公司；400 MHz型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 黃牛肝菌傘多糖的分離純化

根據本課題組前期報道的方法[17]分離純化得到SLPC。

1.3.2 亞硒酸酯化多糖的制備

參考Liu Yuntao等[18]的方法，稱取200 mg SLPC置于300 mL三頸燒瓶中，加入100 mL體積分數0.5%的HNO3溶液，磁力攪拌15 min使多糖完全溶解。加入200 mg亞硒酸鈉，再加入1.00 g BaCl2，70 ℃磁力攪拌7 h后冷卻至室溫。用飽和Na2CO3溶液調節該反應液pH值至6.0后，加入10.0 mL 1.0 mol/L的Na2SO4溶液，振蕩均勻后離心（3 000 r/min、10 min）去沉淀，上清液透析（截留分子質量1 kDa）后減壓濃縮，加入3 倍體積無水乙醇充分沉淀，離心（3 000 r/min、10 min）取沉淀冷凍干燥后即得Se-SLPC。

1.3.3 納米硒多糖的制備

參考Liu Yuntao等[12]的方法，將5 mL SLPC溶液（1.0 mg/mL）與5.0 mL 0.01 mol/L亞硒酸鈉在25 ℃下磁力攪拌混合均勻，超聲（80 W、40 kHz）處理60 min。然后，將5.0 mL現配的抗壞血酸溶液（0.04 mol/L）緩慢加入到上述混合物中，用NaOH和CH3COOH調節反應體系的pH值至7.0，待反應2 h后即得到SLPC-SeNPs復合體。利用納米粒度儀測定剛制備的SLPC-SeNPs復合體的粒徑。同時用等體積的超純水代替SLPC溶液，以相同方法制備無SLPC作分散劑的SeNPs作為對照。

1.3.4 含硒量的測定

硒化多糖的含硒量由電感耦合等離子體質譜分析測定。儀器工作參數：入射功率1 100 W、等離子體氣流量15 L/min、載氣流量1.06 L/min、輔助氣體流量1.2 L/min、氦氣流量0.5 mL/min、霧化室溫度為2 ℃、采樣深度2.5 mm、采樣速率0.5 L/min。

1.3.5 分子質量測定

樣品分子質量由高效液相凝膠滲透色譜分析測定。色譜條件：TSK Gel G 5000 PWxl色譜柱（7.8 mm×30 cm），2410型示差折光檢測器，以超純水作為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

取不同分子質量的葡聚糖標準品2 mg溶于1 mL超純水中，振蕩混勻，按照上述儀器條件進行測定，以保留時間為橫坐標，lgmw為縱坐標，繪制葡聚糖分子質量的標準曲線。稱取2 mg硒多糖樣品按照上述操作步驟測定分析。通過標準曲線和樣品的保留時間，得出樣品的分子質量。

1.3.6 單糖組成測定

采用氣相色譜分析測定單糖組成，根據Liu Yuntao[19]和Gao Yingying[20]等的方法，采用糖腈乙酸酯衍生化法對水解產物進行衍生化：稱取10.0 mg的Se-SLPC樣品溶于2.0 mL 2 mol/L三氟乙酸中，110 ℃水解2 h后除去剩余的三氟乙酸，樣品進行真空干燥后加入具塞試管內，加入10.0 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，置于90 ℃烘箱內加熱30 min后，冷卻至室溫，加入0.5 mL乙酸酐，90 ℃反應30 min，所得產物進行氣相色譜分析。氣相色譜條件：PEG-20M毛細管柱（30 m×0.53 mm），檢測器為火焰離子化檢測器；升溫程序為初始溫度150 ℃保持3 min，以3 ℃/min的升溫速率升至240 ℃，保持20 min，氮氣流量40 mL/min、氫氣流量30 mL/min、空氣流量400 mL/min。以葡萄糖、半乳糖、海藻糖、吡喃木糖、阿拉伯糖和甘露糖為標準品繪制標準曲線，根據保留時間和峰面積確定單糖種類和各單糖的相對含量。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

Se-SLPC的紅外光譜圖由傅里葉變換紅外光譜儀進行測定，取1.0 mg樣品與溴化鉀粉末以質量比1∶100混合，研磨均勻后壓片檢測，掃描波數范圍為4 000～400 cm－1。

1.3.8 核磁共振分析

取50.0 mg的Se-SLPC樣品用D2O溶解后凍干（重復3次），溶于1.0 mL D2O中加入核磁管中。采用400 MHz型NMR儀在室溫下分析1H NMR和13C NMR譜。

1.3.9 SLPC-SeNPs的表征

1.3.9.1 透射電子顯微鏡觀察

采用透射電子顯微鏡分別對SLPC-SeNPs和SeNPs的表面形貌進行表征，放大倍數分別為20 000、40 000。

1.3.9.2 SLPC-SeNPs的穩定性測定

采用馬爾文納米粒度儀的動態光散射模式分別測定SLPC-SeNPs溶液在不同貯存時間（0、20、40、60、80、100、120 d）、溫度（4、25、37 ℃）和pH值（2、4、6、8、10、12）條件下的粒徑，根據粒徑變化探究SLPC-SeNPs的穩定性。

1.3.10 體外抗氧化活性測定

1.3.10.1 DPPH自由基清除活性

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測定根據Blois[21]的方法并略作修改，取不同質量濃度多糖樣品及VC溶液各2.0 mL，分別加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混合均勻后在室溫下避光靜置30 min，在517 nm波長處測定樣品吸光度，以VC作為陽性對照，按照公式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品+DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2為樣品+無水乙醇的吸光度；A0為無水乙醇+DPPH-乙醇溶液的吸光度。

1.3.10.2 ABTS陽離子自由基清除活性

ABTS陽離子自由基清除率的測定根據的Cai Wenfei等[22]的方法并略作修改，取不同質量濃度的多糖樣品溶液和VC溶液各1.0 mL，分別加入4.0 mL ABTS工作液，混合均勻后置于暗處反應6 min，于734 nm波長處測定樣品吸光度，以VC作為陽性對照，以超純水代替多糖樣品溶液中的ABTS工作液作為空白樣品，按照公式（2）計算ABTS陽離子自由基清除率。

式中：A為不含ATBS工作液樣品的吸光度；A0為空白樣品的吸光度；A1為含ATBS工作液樣品的吸光度。

1.3.10.3 O2－·清除活性

O2－·清除率測定參考Wu Yuntao等[23]的方法并稍作修改，取不同質量濃度的多糖樣品溶液和VC溶液各1.0 mL，分別加入4.5 mL 10 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），在25 ℃水浴加熱20 min，然后加入0.2 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后在25 ℃水浴中加熱5 min，最后加入8.0 mmol/L HCl溶液終止反應，于325 nm波長處測定樣品吸光度，每隔30 s測一次，共測定5 min。繪制時間-吸光度曲線，斜率為鄰苯三酚的自氧化速率。以VC作為陽性對照，按照公式（3）計算O2－·清除率。

式中：v為加入樣品后鄰苯三酚的氧化速率；v0為鄰苯三酚自氧化速率。

1.4 數據處理與分析

所有實驗做3次平行，結果以平均值±標準差表示。用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）評估統計的顯著性，然后進行Tukey檢驗，P＜0.05被認為具有顯著性差異。所有統計分析均使用SPSS 22.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 黃牛肝菌子實體的形態學鑒定

通過查閱《中國真菌志》[24]，對樣品進行形態學鑒定。如圖1所示，子實體中等大，菌蓋直徑約5～14 cm，呈半球形，菌蓋邊緣起初微向下卷，后漸平展；菌蓋平滑，表面有短絨毛，以中央最為濃密，菌蓋呈黃褐色，蓋肉呈黃色，厚約1～3 cm，有菌香氣息，傷后變藍；菌柄呈棒狀，或直或微微彎曲，長約6～15 cm，粗約1～3 cm，柄上部呈黃色，向下逐漸變深，基部呈暗黃色。

圖1 黃牛肝菌子實體Fig. 1 Fruiting body of Suillellus luridus

2.2 Se-SLPC的理化性質

以SLPC為原料所制得硒化多糖Se-SLPC的含硒量為1.62 mg/g。根據標準分子質量葡聚糖的標準曲線可求得Se-SLPC的平均分子質量為8.2 kDa，由半乳糖（51.30%）、葡萄糖（34.22%）和少量甘露糖（13.48%）組成，其中半乳糖含量最高。有研究表明，以半乳糖或甘露糖為骨架的多糖具有多種生理活性，如免疫調節作用、抗氧化作用、抗炎作用和抗腫瘤活性等[25]。與SLPC（mw=9.4 kDa）[17]相比，Se-SLPC的單糖組成發生了變化，減少的阿拉伯糖可能是因為硒化修飾過程中較強的酸性環境破壞了多糖的結構，部分支鏈被降解成單糖或者寡糖，在后續透析的過程中被除去[26-27]，從而導致分子質量降低，單糖組成減少。

2.3 Se-SLPC的結構表征

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析結果

傅里葉變換紅外光譜是分析多糖結構的工具之一，通常用來判定糖環的類型和官能團的類型。根據本課題組前期研究可知，SLPC由α-吡喃葡聚糖和β-吡喃葡聚糖組成[17]。一般來說如果在605（Se=O）、760 cm－1（C—O—Se）和1 610 cm－1（O—Se—O）附近出現吸收峰，則說明亞硒酸基團在多糖上發生了取代反應[18,28]。如圖2所示，Se-SLPC在619 cm－1處出現一個新的信號峰，該吸收峰是由Se—O—C伸縮振動造成的[18]，表明SLPC被成功硒化，其他吸收峰均可以與SLPC的紅外圖譜一一對應。

圖2 SLPC和Se-SLPC的紅外光譜Fig. 2 Infrared spectra of SLPC and Se-SLPC

2.3.2 NMR分析結果

NMR能夠提供非常詳細的多糖結構信息，包括單糖組成、α或β-異頭物的構型、糖鏈的構成和序列及其構成多糖的糖單元。根據本課題組前期研究可知，SLPC的主鏈為→6)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Galp-(1→3,6)-α-D-Galpα-D-Galp-(1→6)-β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→3)-α-DGalp-(1→，支鏈由1,3-β-D-Glcp、1,3-α-L-Arap和1,3-α-DManp組成[17]。如圖3所示，與SLPC相比，Se-SLPC在C4位（δ74.78）發生了較大的化學位移，一般來說，發生取代位置所對應碳原子的化學位移會向低場移動[29-30]，因此推測亞硒酸基團可能在(1→6)-β-D-Glcp的C4位發生了取代；在δ79.88處出現一個新的信號峰，該峰是C3向低場移動而產生的，SLPC的主鏈糖苷鍵連接方式主要為1,3-糖苷鍵，因此可能在糖苷鍵連接位點C3處發生了取代反應[29]。綜上所述，Se-SLPC在C4位和糖苷鍵連接位點C3發生非選擇性取代。

圖3 Se-SLPC的NMR譜圖Fig. 3 NMR spectra of Se-SLPC

2.4 SLPC-SeNPs的形貌表征結果

用透射電子顯微鏡分別觀察SLPC-SeNPs和SeNPs的表面形貌特征，結果如圖4所示。由圖4A1、A2可以看出，SLPC-SeNPs呈規則的球狀，且復合體分布較為均勻；而沒有添加SLPC穩定分散的SeNPs出現明顯的團聚現象，且納米顆粒大小很不均勻（圖4B1、B2），證明SLPC可以很好地防止SeNPs聚集，這主要是因為在多糖的分子結構中存在著許多對納米硒形成、穩定和生長有重要作用的氨基、羥基或羧基基團[25]，這些基團可以吸附和包裹納米硒粒子，從而阻止納米硒粒子的團聚。例如以殼聚糖[12]、茶多糖[31]以及蓮藕渣多糖[32]為分散劑分別制備的硒納米粒子呈均勻分散的球形結構，且粒徑均小于未經表面修飾的SeNPs。

圖4 SLPC-SeNPs與SeNPs的表面形貌Fig. 4 Surface morphology of SLPC-SeNPs and SeNPs

2.5 SLPC-SeNPs的穩定性

納米粒子的粒徑及其穩定性是衡量其生物活性和實際應用的關鍵指標，較小尺寸的納米粒子比較大的納米顆粒具有更高的活性[33]。本研究評價了貯存時間、溫度和pH值對SLPC-SeNPs穩定性的影響。如圖5A所示，剛制備（0 d）的SLPC-SeNPs的粒徑為55.46 nm，隨著貯存時間的延長，SLPC-SeNPs粒徑呈逐漸增大的趨勢，當貯存時間延長至100 d時，其粒徑顯著增大（P＜0.05），達到78.90 nm，說明SLPC-SeNPs至少可以在4 ℃下穩定存放80 d左右，具有一定的貯存穩定性。貯存溫度對SLPC-SeNPs穩定性的影響如圖5B所示，在4 ℃下貯存的SLPC-SeNPs粒徑沒有明顯變化；在25 ℃環境下，SLPCSeNPs的粒徑在前15 d無顯著變化（P＞0.05），25 d后顯著增大（P＜0.05）；而在37 ℃環境下，SLPC-SeNPs的粒徑隨著貯存時間的延長而顯著增大（P＜0.05），由此可知，貯存溫度會影響SLPC-SeNPs的穩定性。研究表明多糖的黏度會影響納米硒的穩定性，例如胞外多糖就是因為其較高的黏度從而可以用來穩定納米硒粒子，而且多糖的黏度隨貯存溫度的升高而降低[12]，因此，SLPC-SeNPs在4、25 ℃和37 ℃下的穩定性差異可能是因為SLPC在4 ℃下的黏度高于在25 ℃和37 ℃下的黏度。新鮮制備的SLPC-SeNPs溶液體系的初始pH值約為6.8（對照），如圖5C所示，當溶液pH值為2和4時，SLPCSeNPs的粒徑分別顯著增加至119.93 nm和104.48 nm，這可能是在強酸條件下SLPC的質子化削弱了SLPC與SeNPs之間的靜電相互作用[34-35]，從而導致SLPC-SeNPs的聚集。而當pH值在6～12范圍內時SLPC-SeNPs的粒徑無顯著變化。

表1 SLPC、Se-SLPC、SLPC-SeNPs的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of SLPC, Se-SLPC and SLPC-SeNPs

圖5 SLPC-SeNPs的穩定性Fig. 5 Stability of SLPC-SeNPs

2.6 兩種富硒黃牛肝菌傘多糖體外抗氧化活性

硒化可以通過活化多糖異構碳上的氫原子提高多糖的抗氧化活性，以VC作為陽性對照，通過體外實驗分別評價SLPC、Se-SLPC和SLPC-SeNPs的抗氧化活性，結果如表1所示。在質量濃度0.5～3.0 mg/mL范圍內，SLPC、Se-SLPC、SLPC-SeNPs對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和O2－·的清除能力均表現出質量濃度依賴性，且Se-SLPC、SLPC-SeNPs的清除能力均強于SLPC。此外，SLPC-SeNPs的體外抗氧化活性整體上略強于Se-SLPC，可能是因為納米硒具有尺寸效應和表面效應[36]?？傊?，Se-SLPC和SLPC-SeNPs綜合了硒和SLPC的優點，與單一的SLPC相比較大程度提高了抗氧化活性。

3 結 論

本實驗以SLPC為原料，分別制備了Se-SLPC和SLPC-SeNPs兩種硒-多糖復合物，主要得出以下結論：Se-SLPC的含硒量為1.62 mg/g，由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，平均分子質量為8.2 kDa，NMR分析結果表明亞硒酸基團在(1→6)-β-D-Glcp的C4位和糖苷鍵連接位點C3發生了取代。SLPC-SeNPs呈均勻規則的球形結構，粒徑為55.46 nm，在4 ℃下能穩定保持至少80 d。乳液、水凝膠等是良好的載體材料，一些復合型乳液或水凝膠具有耐強酸或是溫度、pH值響應性釋放的功能。在后續的研究中可以考慮采用以多糖、蛋白質、淀粉及其衍生物為原材料制備的乳液或水凝膠作為載體，以包埋、共價結合等形式與SLPC-SeNPs相互作用，減少SLPC-SeNPs在強酸環境中的聚集，從而提高富硒多糖的實際應用價值。此外，Se-SLPC和SLPC-SeNPs的抗氧化活性均顯著高于SLPC，是具有良好應用前景的補硒劑和抗氧化劑。