Wnt5a在結直腸癌發病中分子機制的研究現狀

孫衛民，李淑蘭，謝建軍

（河北省三河燕郊福合第一醫院外科，河北 三河 065201）

Wnt 信號通路是一個復雜的蛋白質作用網絡，在生物進化中極為保守，通過多環節、多作用位點調控生物體正常的生長發育。Wnt 通路與其他細胞信號通路間互相交叉，構成復雜的調控體系，并與腫瘤的發生和生長有關。Wnt 蛋白在功能上通常分為典型和非典型Wnt 配體兩類，分別激活典型和非典型Wntβ-連環蛋白信號級聯，調節細胞增殖、遷移、分化和極性過程[1]。本文闡述了非典型Wnt 配體——Wnt5a 在結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）發病中的分子機制和臨床意義。

1 Wnt 通路調控的特點

在典型Wntβ- 連環蛋白信號通路中，靶基因的表達受Wnt 配體存在和缺失的影響。生理條件下，當Wnt 配體與跨膜受體卷曲蛋白（frizzelds，Fzd）的胞外區結合后，β- 連環蛋白轉位進入細胞核，與特定的轉錄因子如T 細胞因子/ 淋巴樣增強結合因子緊密結合，刺激參與細胞增殖和分化的靶基因表達[2]。當Wnt 配體缺乏時，β- 連環蛋白被降解，主要復合物成分包括糖原合成酶激酶3β、腺瘤樣結腸息肉易感基因蛋白和軸蛋白被破壞并泛素化，影響細胞信號通路的轉導[1]。與典型Wntβ- 連環蛋白信號相反，非典型Wnt 信號可獨立于β- 連環蛋白，通過激活Wnt/Ca2+和平面細胞極性（planar cell polarity，PCP）通路，調節Wnt 非典型配體的表達和其他細胞的代謝過程。其中，Wnt5a 是一種研究較多的非典型Wnt 配體。研究發現，隨著Wnt 非典型配體與Fzd 受體結合并激活散亂蛋白，PCP 信號通路被觸發，通路的其他細胞內介質，包括Rho、Rac、Rho 相關激酶和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）也分別被激活。激活后的PCP 信號通路在調節肌動蛋白聚合和肌凝蛋白活化中起關鍵作用[3]。與PCP 通路相反，Wnt/Ca2+信號通路也可由Wnt5a 和Ror2 受體之間的相互作用而觸發，導致磷脂酶C 誘導產生肌醇1,4,5三磷酸和1,2 二?；视?，形成膜結合4,5- 二磷酸。隨后，活化的肌醇1,4,5 三磷酸促使內質網釋放Ca2+，激活多種轉錄因子，包括鈣/ 鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ誘導的核因子-κB 和蛋白磷酸酶、鈣調磷酸酶誘導的T 細胞相關核因子，在調節細胞黏附、細胞骨架更新、遷移和組織細胞分離方面發揮重要作用[4]。Wnt5a 通過靶向腫瘤細胞中廣泛存在的多種病理過程，包括細胞衰老、化療耐受、腫瘤細胞微環境、腫瘤相關炎癥反應、上皮間質轉化、細胞增殖、細胞侵襲和遷移等，介導抑癌和致癌作用。Wnt5a 的表達水平決定了其在特定腫瘤分型中作為抑癌基因或致癌基因的功能。Wnt5a 也是一種自分泌和旁分泌分子，在不同腫瘤分型中，刺激相關的致癌和抑癌信號[3]。

2 Wnt5a 信號轉導在CRC 中的致癌作用

Wnt5a 的致癌作用，可能通過特定細胞介導而影響CRC 腫瘤細胞的代謝過程，包括腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。TAMs誘導Wnt5a 表達后，刺激腫瘤細胞增殖和CRC 的HCT116 和DLD1 細胞遷移，并強化巨噬細胞浸潤。Wnt5a 對TAMs 的自分泌作用也是促進CRC 腫瘤細胞生長的重要途徑。wnt5a 自分泌刺激TAMs-M2 極化，作為TAM 亞型，引發細胞增殖、遷移和CRC的HCT116 和DLD1 細胞侵襲，使TAMs 分泌白細胞介素-10 明顯增加。由于Wnt5a 在CRC 細胞中的表達水平較高，故該配體可逐步影響腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等不同細胞過程[5]。在可誘導的Wnt5a 轉基因小鼠模型中，也觀察到Wnt5a 可刺激CRC 細胞的定向遷移和侵襲[1]。Wnt5a 非典型信號通路的下游作用靶點是鈣/ 鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱγ，后者可作為腫瘤微環境中腸上皮細胞高表達的調節因子。在右旋糖酐硫酸酯鈉誘導的結腸炎相關癌中，通過過表達Wnt5a 以及Wnt5a 受體和Wnt5a 輔受體Fzd-2、-5 和Ror2，促進了炎癥信號的傳遞并導致腸上皮細胞損傷。腸上皮細胞過表達Wnt5a 及其受體/ 輔受體后，Wnt5a 顯著增加了蛋白激酶Ⅱγ 的磷酸化，在結腸炎相關癌發病的過程中，過度激活上皮信號轉導器和轉錄激活因子-3 信號，最終影響結腸上皮細胞的存活和增殖[6]。

其他細胞信號作用通路也影響Wnt5a 的致癌作用。瞬時受體電位通道家族成員TrpC5 在CRC 細胞中呈高表達，在調控結腸腫瘤細胞分化中發揮重要作用。與腫瘤微環境區調控分泌因子一致，TrpC5 可激活非選擇性可滲透Ca2+通道。研究表明，表達TrpC5的低分化CRC 細胞株SW480、HT-29、SW620、DLD1、HCE8693 和RKO 可上調Wnt5a 和細胞質β- 連環蛋白表達，最終導致CRC 細胞分化減少及干細胞化增強[7]。而β- 連環蛋白能促進許多原癌基因的表達，是許多原癌基因的產物，受多種調節因子的影響。細胞內β- 連環蛋白豐度、分布以及功能的變化，可影響生物的胚胎發育、能量代謝等系列生理過程，甚至會導致腫瘤的發生及惡化等事件[2]。因此，Wnt5a的致癌作用與β- 連環蛋白密切相關。Wnt5a 的另一種調控因子是叉頭盒轉錄因子M1（forkhead box transcription factor M1，FOXM1），它是一種與細胞增殖相關的轉錄因子，通過調節腫瘤微環境樹突狀細胞中靶基因的表達，在腫瘤的發生中發揮重要作用。在骨髓來源樹突狀細胞中，通過增加H3 賴氨酸79 的去甲基化，使FOXM1 活化后激活Wnt5a 非典型信號通路，抑制樹突狀細胞形成正常的細胞表型和功能。Wnt5a 也能通過降低FOXM1 啟動子去甲基化，抑制樹突狀細胞成熟表型的形成，影響腫瘤細胞的增殖和分化[8]。

3 Wnt5a 作為CRC 腫瘤抑制因子的臨床價值

Wnt5a 作為CRC 的腫瘤抑制因子也是通過多通道、多模式的相互交叉作用實現的。表觀遺傳修飾誘導調控Wnt5a 的表達水平，可能是決定Wnt5a 在CRC 細胞中具有腫瘤抑制作用的途徑之一[9]。在CRC的不同發展階段，Wnt5a 的表觀遺傳可能發生動態改變。Wnt5a 異常的甲基化水平與CRC 的臨床病理特征有關，包括最大腫瘤直徑、腫瘤侵襲范圍、腫瘤部位、組織學分型等[1]。在異位模型中誘導Wnt5a 過表達，可抑制上皮- 間質轉化、典型Wnt 通路以及HCT116 細胞株中Wnt/Ca2+信號的過度激活，進一步強化了Wnt5a 對原發性結腸癌的腫瘤抑制作用。研究表明，CRC 細胞中甲基化誘導的Wnt5a 沉默，通過下調β- 連環蛋白水平和Wntb- 連環蛋白信號失活，可抑制腫瘤細胞的克隆性[10]。Wnt5a 甲基化水平與微衛星不穩定性等腫瘤特征顯著增加相關聯，包括存在錯配修復蛋白、MLH1 甲基化、近端病變、黏液類型、女性患者等[8]。此外，甲基化引起CRC 細胞中Wnt5a表達水平降低，與化療藥物5- 氟尿嘧啶（5-FU）的腫瘤抑制作用呈負相關。而由Wnt5a 異常甲基化誘導的Wnt5a 表達缺失與淋巴結浸潤和TNM 晚期分型顯著相關，提示Wnt5a 在CRC 患者中起抑癌基因的作用。

研究發現，siRNA 誘導敲除Wnt5a 的低甲基化LoVo 和SW480 細胞后，5-FU 的抗腫瘤效果強于過表達Wnt5a 的高甲基化HCT116 和SW620 細胞，提示Wnt5a 表達缺失可降低5-FU 對CRC 細胞的抑制作用[10]。在CRC 患者中，Wnt5a 甲基化水平受維生素D 攝入量的影響，維生素D 可使Wnt5a 甲基化水平降低以抑制細胞增殖，通過減少維生素D 的攝入可提升Wnt5a 的高甲基化水平[7]。由于SW480 細胞株中Wnt5a 的甲基化水平通常會降低，在轉化生長因子-β 處理的SW480 細胞中，通過激活增強子zeste 同源物2 誘導Wnt5a 啟動子H3K27 的高甲基化，從而可降低Wnt5a 的表達水平[11]。另外，CRC細胞啟動子區域組蛋白修飾可引起Wnt5a 表達缺失，給予組蛋白去乙?；敢种苿?，包括曲古菌素A 和丁酸鈉后，與無轉移的人CRC 細胞株SW480 相比，高轉移人CRC 細胞株SW620 通過增加其啟動子區H3Ac、H4Ac 和H3K4me2 組蛋白乙?；?，增加了Wnt5a mRNA 和蛋白的表達水平[12]。采用重組Wnt5a（rWnt5a）或Wnt5a 模擬肽Foxy-5 處理CRC細胞系HT-29 和Caco-2，在前列腺素E2分解代謝中，通過促進抑癌酶15-羥基前列腺素脫氫酶（15-PGDH）的過表達和Wntβ- 連環蛋白信號的減少，能抑制細胞增殖和促進細胞分化[13]。利用結腸細胞外鈣敏感受體刺激HT-29 細胞的Wnt5a 表達，通過誘導Ror2和缺失同源物2 過表達，以及Wntβ- 連環蛋白信號失活，可抑制細胞增殖。將脂多糖加入到RAW264.7小鼠巨噬細胞或HT-29 細胞中，可刺激腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，使Wnt5a 的表達水平顯著增加，導致HT29 CRC 細胞系中TNF 受體1 激活，通過過表達Ror2 調控Wnt3a 典型信號通路[14]。多項研究均發現了Wnt5a 的腫瘤抑制作用。在CRC 的不同腫瘤細胞中，Wnt5a 的表達水平不是固定不變的，多種介質的調控共同決定了Wnt5a 腫瘤抑制作用功能的實現。Wnt5a 對CRC 不同組織細胞類型和腫瘤組織的抑制作用表明，該蛋白可能成為抑制CRC 進展的關鍵治療靶點。Wnt5a 表達缺失也與CRC 不同階段的臨床病理特征之間存在關聯。與組蛋白修飾誘導的Wnt5a 高甲基化一致，Wnt5a 表達水平下調與Ⅲ、Ⅳ期CRC 以及CRC 組織的淋巴結浸潤程度呈正相關。Wnt5a 低表達與CRC 患者年齡、性別、腫瘤大小、組織學分化和復發無關，而與轉移性組總生存率顯著降低有關[15]。提示通過檢測Wnt5a 甲基化水平可能對CRC 不同腫瘤亞型患者的預后做出預判。

4 小結

綜上所述，Wnt5a 在CRC 不同階段的致癌和抑癌作用表明，Wnt5a 與其他細胞通路相互交叉，對CRC 細胞的增殖、分化產生影響。Wnt5a 在CRC 發病機制中的重要性，可能成為有臨床價值的候選靶點。未來需要對Wnt5a 特異性拮抗劑作為CRC 新的治療策略進行相關研究，以探索CRC 基于Wnt5a 分子靶向治療的可行性。