不同濃度CB對小鼠紡錘體移植后重構卵細胞骨架及囊胚發育影響的研究

王啟航，王 偉，王偉周，商 微

(1.中國解放軍總醫院第七醫學中心生殖醫學科，北京 100700;2.中國人民解放軍總醫院第六醫學中心生殖中心，北京 100037;3.中國人民解放軍總醫院第七醫學中心婦產醫學部，北京 100700)

線粒體是真核細胞中必不可少的細胞器，主要通過氧化磷酸化(oxidative phosphrylation,OXPHOS)產生細胞能量[1]。線粒體疾病是指線粒體基因組和(或)核基因組突變，導致細胞OXPHOS障礙引起的一類疾病，目前尚無方法治愈[2]。在大多數病例中，臨床表現往往各不相同，疾病譜重疊[3]。兒童每10萬人中5～15人患病[4]，成年人每10萬人中12.5人患病，在所有致病性突變中每10萬人中23人患病[5]。目前預防重線粒體DNA(mtDNA)疾病遺傳的常規方法包括產前診斷和胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)。產前診斷是一種對不同妊娠早期階段的細胞進行采樣的技術，可用于降低嚴mtDNA疾病地風險，并可在突變負荷高時選擇終止[6]。產前診斷的主要困難是mtDNA突變負載在不同組織之間可能不同，也可能取決于取樣時的胎兒發育階段[7]。PGD技術開發于30年前[8]，最近幾年才應用于減少或消除mtDNA疾病。該技術是從早期胚胎中取出的一個或多個細胞進行基因檢測，并選擇無突變或低突變負荷的胚胎移植到子宮[9-10]。但PGD并不適合所有攜帶致病性mtDNA突變的患者，包括具有同源mtDNA突變或僅產生高突變負荷的患者。然而，女性患者必須生產出突變水平低于疾病表達臨界閾值的胚胎，才有可能生育一個健康的嬰兒。這就有了對替代技術的需要，以減少mtDNA疾病的遺傳風險，如核質置換技術[3]。核質置換技術是從攜帶mtDNA突變的卵母細胞或受精卵中取出細胞核，然后轉移到的去核供體卵母細胞或受精卵中。該技術包括生發泡移植[11-12]、極體移植[13-14]、紡錘體移植[15-16]、原核移植[17-18]等。其中紡錘體移植是迄今為止研究最充分的核質置換技術。有大量數據顯示該技術安全性最強，最具臨床轉化及臨床推廣潛力。本研究小鼠紡錘體移植，采用不同濃度的細胞松弛素B(cytochalasin B,CB)處理，通過檢測重構卵母細胞骨架和統計重構胚胎發育情況，篩選出更優CB濃度，為人類紡錘體移植技術提供可靠的實驗數據。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 小鼠品系為C57BL/6清潔級小鼠，購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司。雌鼠周齡為6～8周，雄鼠月齡為6～7個月。CB(Sigma，德國)、仙臺病毒(Hemagglutinating virus of japan,HVJ)(ISK，日本)、PMSG(寧波三生，中國)、絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)(寧波三生，中國)、4%多聚甲醛(Sigma，德國)、小鼠抗β-微管蛋白抗體(Sigma，德國)、Triton X-100(Sigma，德國)、FITC-山羊抗鼠抗體(Sigma，德國)、FITC標記的鬼筆環肽(Solarbio，中國)、DABCO聚乙烯醇封片劑(Sigma，德國)

1.2實驗方法

1.2.1卵子準備 雌性C57BL/6小鼠腹腔注射PMSG 10 U,48 h后注射hCG 10 U誘導超排，注射hCG14～16 h后取卵，挑選形態正常的MⅡ期卵母細胞(形態飽滿，光亮)，用體外操作液洗3次。再轉移到過夜平衡的受精液中，置于培養箱中待用。

1.2.2紡錘體移植(spindle transfer，ST)及分組 ST是指從MII期卵母細胞中取出紡錘體-染色體復合物，并將其轉移到另一個已去核的MII期卵母細胞中的過程。將準備好的卵子放在含有不同濃度CB操作液中孵育,時間均為5 min。用持卵針固定住卵，在偏振光鏡下將紡錘體擺放成梭形，置于12～1點鐘位置，再用激光打透紡錘體對應部分的透明帶，去核針經透明帶缺口輕輕地吸出紡錘體-染色體復合物，注意盡量少帶紡錘體周圍的胞漿。然后把取出的細胞核轉移到HVJ-E中浸泡10 s左右，再將帶有HVJ-E的細胞核注入另外已經去核的卵母細胞的卵周間隙中，最后將其轉入受精液中繼續孵育，觀察融合情況。分組：CB濃度7.5 mg/L為常規組、CB濃度3.5 mg/L為低劑量組、CB濃度10 μg/mL為中劑量組、CB濃度12.5 mg/L 高劑量組。

1.2.3精子獲能 成年健康的公鼠斷頸處死，迅速分離出附睪尾和輸精管，剪下附睪尾(盡可能去除脂肪)，在體式鏡下用精細剪將附睪尾剪 2～3 下，用鑷子輕輕擠出精子，然后將其轉移到過夜平衡的精子獲能液中，再置于CO2培養箱中獲能,獲能1 h后行體外受精(in vitro fertilization,IVF)。獲能好的精液呈云霧狀，雜質少。

1.2.4IVF 各組重構卵，洗滌后分別置于過夜平衡的20 μL受精液中(每滴放小于或等于10枚)， 然后將1 μL已獲能的精液加入到有卵母細胞的受精液滴中，放入37 ℃/ 6%CO2/5%O2培養箱，IVF 6 h后觀察受精情況，并轉移到卵裂液中繼續培養。

1.2.5囊胚細胞計數 各組挑選出20枚左右擴張期囊胚，分別用4%多聚甲醛固定，室溫30 min；1%PVA/PBS液清洗3次，5 min/次；將囊胚放入配制好的10 mg/L Hoechst 33342中染核，室溫避光孵育15 min；1% PVA/PBS液再清洗3次，5 min/次；將處理好的囊胚轉移到載玻片上，用DABCO聚乙烯醇防熒光淬滅封片劑封片；在熒光顯微鏡下觀察，用紫外光激發藍色熒光，統計囊胚細胞總數。

1.2.6微管β-Tubulin蛋白和微絲的免疫熒光染色 本實驗對各組重構卵母細胞融合后0.5 h、1 h、2 h進行取樣固定。簡單介紹染色過程如下：各組重構卵母細胞通過連續激光打孔方式去除透明帶，清洗，用 4%多聚甲醛中固定半小時，轉移到0.5%TritonX 100中，清洗，轉移到含有1%BSA的封閉液中。處理好的卵放入1∶200封閉液稀釋的小鼠抗β-微管蛋白抗體中，4 ℃冰箱過夜；然后轉入1∶1 000封閉液稀釋的二抗(山羊抗鼠抗體)中，室溫避光1 h；再轉移到1∶100封閉液稀釋的TRITC標記鬼筆環肽液中，室溫避光1 h；最后轉移到1∶200清洗液稀釋的DAPI中，室溫避光5～10 min。根據蓋玻片的大小，把凡士林/石蠟混合物，滴在干凈的蓋玻片上做4個小柱，在4個小柱中間滴上1%PVA/PBS液1 μL，將處理好的卵轉到1%PVA/PBS液中，小心蓋壓，使樣品位置固定，用DABCO聚乙烯醇防熒光淬滅封片劑封片。低溫保存，盡快用共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

1.3Aipathwell免疫熒光分析

1.3.1分析方法 采用AI深度學習原理，基于海量數據進行算法訓練并集成為自動化圖像分析軟件。具體過程如下，①循跡：自動定位并沿待測組織圈定待測區域，可根據具體要求手動定位；②選色：根據HSI自動進行陽性判斷，可根據具體情況手動修正；③運算：根據需求，軟件自動定位細胞核并擴展胞質范圍；計算陽性細胞數量以及面積；累積光密度 (integrated optical density,IOD)；組織面積等不同參數；④分析：高倍下逐步計算待測區域。完成后根據原始基礎數據以及算法公式自動對各個項目進行計算得出分析結果。

1.3.2評價項目 陽性強度，個陽性點顏色深淺的平均值：反應整個片子或者某個區域陽性的平均深淺度。明場為平均光密度，暗場為平均強度，數值越大陽性程度越強。平均光密度值=累積光密度值陽性像素面積。

1.4統計學方法 應用SPSS21.0統計軟件分析數據。計量資料采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1比較各組移植效率 低劑量組、中劑量組、高劑量組與常規組相比，注核率、融合率差異無統計學意義，即小鼠紡錘體移植效率差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組移植效率比較Table 1 Comparison of transplantation efficiency in each group (株數，%)

2.2比較各組胚胎發育情況 高劑量組的受精率低于常規組(P<0.05)；高劑量組的囊胚率、孵化率低于常規組(P<0.05)。見表2。

表2 各組胚胎發育情況比較Table 2 Comparison of embryonic development in each group (株數，%)

2.3比較不同濃度CB重構小鼠囊胚細胞總數 為了避免胚胎級別對實驗結果的影響,所有實驗均選擇擴張期囊胚進行實驗。高劑量組的囊胚細胞總數少于常規組(P<0.05),中劑量組的囊胚細胞總數多于常規組(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 各組囊胚細胞總數比較Table 3 Compared the total number of blastocysts in each group

圖1 各組囊胚免疫熒光染色A.常規組；B.低劑量組；C.中劑量組；D.高劑量組Figure 1 Immunofluorescence staining of blastocysts in each group

2.4免疫熒光染色比較重構小鼠卵母細胞骨架恢復情況 融合后0 h觀察，微絲出現在紡錘體周圍；融合后1 h觀察，逐漸出現在皮質區域；融合后2 h觀察，各組基本恢復正常。低劑量組、中劑量組、高劑量組和常規組相比，不同時間重構小鼠卵微絲陽性比率差異無統計學意義(P>0.05)；但不同時間各組微絲的平均光密度值，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，時間點間比較有差異(P<0.05)，組間的時間變化趨勢差異有統計學意義(P<0.05)，即不同濃度CB和不同觀察時間對小鼠重構卵細胞骨架恢復情況均有影響，且差異有統計學意義。見表4,5和圖2～4。

圖2 各組融合后0 h細胞骨架恢復情況Figure 2 Cytoskeletal recovery in each group at 0 h after fusion

表4 不同時間各組微絲的陽性比率比較Table 4 Comparison of the positive ratio of microfilaments in each group at different time points (個數，%)

表5 不同時間各組微絲的平均光密度值比較Table 5 Comparison of the average optical density of microfilaments in each group at different time points

圖3 各組融合后1 h細胞骨架恢復情況Figure 3 Cytoskeletal recovery in each group at 1 h after fusion

圖4 各組融合后2 h細胞骨架恢復情況Figure 4 Cytoskeletal recovery in each group at 2 h after fusion

3 討 論

線粒體病是因遺傳缺陷引起線粒體代謝酶的缺陷導致APT合成障礙，能量產生不足而出現的一組系統疾病，目前臨床不能治愈。核質置換技術的優勢是可以有效預防突變mtDNA向子代傳遞，已在人類和動物模型上得到了證實。雖然臨床上已有通過核質置換技術出生的嬰兒，但是實驗過程中重構囊胚效率及質量較低，且可用于移植的囊胚極少。因此，現階段提升核質置換技術效率和重構囊胚的質量，已本領域研究的重點、難點和熱點。1983年McGrath和Solter開發了小鼠原核移植，并獲得子代，由此奠定了核質置換技術的基礎。即從一個受精卵中取出原核，注入到另一個去核的胞質中，細胞骨架抑制劑(CB和秋水酰胺)的前提下，使得原核很容易被取出，從而提高了受精卵的存活率。96%的重組受精卵發育到桑椹胚或囊胚階段，移植到假孕雌鼠后產生活的后代(活出生率:16%)。該研究中CB濃度為5 mg/L，原核移植效率為90% 左右[19]。2013年，Tachibana等[20]發表了第一篇人類卵紡錘體移植的文章，該研究進一步證實核質置換技術的可行性，同時報道卵胞質內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后，出現相當比例的受精異常。與正常組比較，人類重構卵的異常受精率更高(分別為13%、52%)，但在非人類靈長類紡錘體移植后受精卵中未觀察到，這可能是由于摘除和轉移過程中卵母細胞過早激活或紡錘體損傷所致。在本研究中未觀察到小鼠重構卵異常受精，考慮可能與細胞融合方式或受精方式有關。該研究人紡錘體移植使用的CB濃度為5 mg/L，重構卵正常受精的囊胚率是62%，對照組囊胚率是76%；而且重構胚胎中核相關的mtDNA含量很低。2017年，張進教授等報道了世界第一例人紡錘體移植活體嬰兒出生。由張進教授等在墨西哥操作完成，并順利活產一名健康男嬰?；颊邽橐幻?6歲的女性，經歷了四次流產，活產兩名兒童，但由于母親遺傳的mtDNA突變(>95%)水平過高而死亡，已知這種突變可導致Leigh綜合征(m.8993T>G)。該研究人紡錘體移植，使用的CB濃度為7.5 mg/L，重構卵中受精5枚，有4枚發育至囊胚。選擇胚胎移植的重構囊胚中，mtDNA突變負荷的平均水平為5.73%，而出生后采集的多個組織中mtDNA突變負荷的平均水平為(1.60±0.92)%[21]。以上研究均未提及不同CB濃度對移植效率及胚胎發育情況的探討，本課題發現不同濃度CB對小鼠紡錘體移植效率差異無統計學意義，但是會影響重構囊胚質量。

2011年，Hu等[22]研究了CB對ICSI胚胎存活和體外發育的影響，該研究結果顯示，與未經CB處理的對照組相比，用5 mg/L CB處理的ICSI胚胎的存活率顯著提高，但2組的受精率、卵裂率和囊胚率均沒有顯著差異。 該研究發現正常卵母細胞經過5 mg/L CB處理后，紡錘體立即與質膜平行，并且微絲無法檢測到。CB處理后0.5 h，在紡錘體周圍觀察到微絲(31/34，91.2%)；1 h后，逐漸出現在皮層區域(31/33，93.9%)；2 h后，已完全恢復(34/34，100%)， 該研究表明CB處理對微絲無影響。本研究通過免疫熒光染色，觀察小鼠卵的細胞骨架，并進行定量分析，比較不同時間重構小鼠卵微絲陽性比率及光密度值，結果顯示重構小鼠卵微絲陽性比率無差別，但是不同濃度CB和不同觀察時間對重構小鼠卵細胞骨架恢復情況均有影響，且有統計學差異。

綜上所述，在本研究選取的CB濃度范圍內，中劑量組優于常規組。CB在紡錘體移植中的作用是松弛細胞骨架，在胞質完整的前提下，細胞核更容易取出，探討不同濃度CB在核移植過程中對重構卵母細胞骨架及胚胎發育的影響，旨在增加紡錘體移植的安全性，降低核移植對重構卵細胞骨架的影響，促進重構胚胎的發育，獲得更優質囊胚。