基于3A組裝的多拷貝基因策略優化重組水蛭素變體Ⅲ的生產

王亞麗,劉秀霞,楊艷坤,白仲虎*

1(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

水蛭素(Hirudin,H)是一種從水蛭唾液中提取的小分子多肽,具有3個分子內二硫鍵[1]。它能特異性結合凝血酶,是目前發現的最強凝血酶天然抑制劑[2]。水蛭素有3種主要亞型,分別為水蛭素變體(Hirudin varidant, Hv)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(Hv1, Hv2, Hv3)[3],它們具有相似的N端核心結構域和對凝血酶的抑制活性。其中Hv3除了具有抗凝血作用外,在預防和治療白內障方面也表現出巨大潛力[4]。目前,一些水蛭素變體已經在大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌、絲狀真菌、轉基因植物、酵母菌等[4-10]多種底盤細胞中成功表達。MENDOZA-VEGA等[11]利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) C13ABYS86表達Hv2時產量達到500 mg/L,但是其發酵周期長達60 h;KIM等[7]利用GAL1啟動子在S.cerevisiae中表達水蛭素,發酵72 h產量才能達到62.1 mg/L;MATSUI等[12-13]通過構建豬腺苷酸激酶蛋白與重組水蛭素變體I(recombinant Hirudin varidant I, Rhv1)融合表達載體,實現了Rhv1在E.coli中的高水平表達,但是其以包涵體形式存在,產物沒有活性。HUANG等[4]開發了一種穩定表達Rhv3的方法,并通過補料分批發酵使得Rhv3產量達到915 mg/L。然而S.cerevisiae、轉基因植物、絲狀真菌等發酵周期長;E.Coli具有內毒素、純化工藝復雜,其大規模生產仍然具有不小的挑戰。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種高GC含量、無內毒素的革蘭氏陽性細菌,常被用來生產氨基酸等小分子物質[14-15]。由于其胞外蛋白酶活性低、具有Sec、Tat兩種強大的蛋白分泌體系,被認為是一種新型重組蛋白表達系統。利用C.glutamicum表達系統進行重組蛋白生產不僅能縮短發酵周期,而且可以規避E.coli表達系統內毒素、純化難的問題,降低重組蛋白生產成本。

本研究利用實驗室前期開發的3A組裝系統,在C.glutamicun中構建以組成型啟動子Ptac控制表達的1～7拷貝Rhv3重組菌株,并且每一個Rhv3基因的構建過程中將信號肽進行替換,以實現Rhv3的高效分泌。同時在Rhv3基因的C端添加6個組氨酸標簽,最終僅需通過簡單的Ni2+純化即可獲得高純度Rhv3蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

TaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒,CWBIO;限制性內切酶、Ligation Mix,TakaRa;牛纖維蛋白原、凝血酶,索萊寶;所有試劑和化學品均為分析純試劑。

1.1.2 菌株、質粒

不同核糖體結合位點(ribosome binding site,RBS)-目標基因融合質粒所用引物見表1。引物合成和測序由蘇州安升達完成。

表1 本實驗所用引物

本研究中所構建菌株如表2所示。

表2 本實驗所用菌株

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10,用于培養E.coliDH5α。

LBB培養基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10,腦心浸出液 10,用于C.glutamicumCGMCC1.15647重組菌株培養。

CGXⅡ培養基:葡萄糖 40 g/L;尿素 5 g/L;硫酸銨 20 g/L;K2HPO41 g/L;MgSO4·7H2O 0.25 g/L;CaCl210 mg/L;FeSO4·7H2O 10 mg/L;MnSO4·H2O 10 mg/L;ZnSO4·7H2O 1 mg/L;0.2 mg/L CuSO4;NiCl·6H2O 0.02 mg/L;原兒茶酸30 mg/L;3-嗎啉丙磺酸(3-morpholinopropanesulfoinc acid,MOPs) 42 g/L,用于C.glutamicumCGMCC1.15647重組菌株培養。

BHI培養基:腦心浸出液 37 g/L,用于C.glutamicumCGMCC1.15647重組菌株培養。

1.1.4 儀器與設備

LongGene A 300 PCR儀,朗基科學儀器有限公司;DYCZ-24DN電泳儀,北京六一儀器廠;MicroPulser電擊轉化儀,Bio-Rad (USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 單拷貝基因表達載體構建

課題組前期以BioBrick為基礎,在C.glutamicum中構建了含不同抗性基因的3A組裝系統[16]?？寺≠|粒p3A-Amp、p3A-Kan、p3A-Chlr上含有EcoR I、NheI、SpeI和PstI 4個限制性內切酶位點。NheI、SpeI為一組同尾酶,經酶切后產生相同的黏性末端。在組裝時兩個黏性末端連接,形成不被其中任何限制性內切酶識別的間隔序列(Scar)。

標準化組成型啟動子Ptac采用EcoR I、NheI酶切,標準化egfp質粒使用SpeI、PstI酶切,標準化p3A-Kan質粒使用EcoR I、PstI酶切。經80 ℃滅活后,按照4∶4∶1比例連接,構建以Ptac控制表達的單拷貝egfp質粒。同樣地,構建以Ptac啟動子、CspA信號肽控制分泌表達的單拷貝Rhv3質粒。

1.2.2 多拷貝基因表達載體構建

RBS-egfp質粒構建:以p3A-egfp-Kan為模板,使用引物3A-RBS-F和p3A-R進行PCR擴增(圖1-A),將不同RBS序列引入egfp基因ATG之前。獲得的片段使用EcoR I、PstI酶切后,將目的片段連入經EcoR I、PstI酶切的p3A-Amp中,得到含不同RBS序列的p3A-RBS-egfp-Amp質粒。

A-適用于3A組裝系統的RBS通用引物示意圖;B-基于3A組裝的多拷貝質粒構建示意圖

多拷貝egfp質粒構建:分別利用上述質粒與實驗室前期構建的p3A-Ptac-egfp-Kan進行3A組裝,獲得含不同RBS序列的兩拷貝egfp表達質粒(圖1-B)。具體操作步驟參照圖1-B。

RBS-CgR0949-Rhv3、RBS-PorB-Rhv3、RBS-CspA-Rhv3、RBS-CspB-Rhv3、RBS-Cg1514-Rhv3質粒構建:分別以p3A-CgR0949-Kan、p3A-PorB-Kan、p3A-CspA-Kan、p3A-CspB-Kan、p3A-Cg1514-Kan為模板,使用引物3A-SD1-F和p3A-R進行PCR擴增(圖1-A),將RBS1序列引入信號肽基因CgR0949、PorB、CspA、CspB、Cg1514的ATG之前。得到的片段使用EcoR I、PstI酶切,連接到p3A-Amp中,得到p3A-RBS1-CspA-Amp、p3A-RBS1-CgR0949-Amp。上述質粒經EcoR I、NheI酶切,標準化Rhv3質粒經SpeI、PstI酶切,連接至經EcoR I、PstI酶切的p3A-Chlr中,獲得p3A-RBS1-CgR0949-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-PorB-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-CspA-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-CspB-Rhv3-Chlr、p3A-RBS1-Cg1514-Rhv3-Chlr(圖1-B)。

多拷貝Rhv3質粒構建:分別利用上述質粒與單拷貝p3A-Ptac-CspA-Rhv3-Chlr進行3A組裝,獲得含不同信號肽序列的兩拷貝Rhv3表達質粒。接著選擇最優表達菌株對應質粒按照上述步驟進行多輪(×N rounds)構建,獲得多拷貝Rhv3表達質粒。具體操作步驟參照圖1-B。

1.2.3 質粒轉化

上述質粒采用電轉化方法引入宿主細胞C.glutamicumCGMCC1.15647中[17]。

1.2.4egfp熒光強度分析

將含有不同RBS序列的兩拷貝egfp重組菌株接種到24孔板中過夜培養。按2%接種比例轉接到含新鮮LBB培養基的24孔板中發酵24 h。取待測菌液0.2 mL,使用培養基將OD600值調至0.5左右,使用熒光分光光度計測定菌體熒光值(激發波長和發射波長分別為488 nm和507 nm)。最后計算單位OD600值熒光強度以指示不同RBS翻譯強度。

1.2.5 Rhv3表達、純化分析

將重組菌接種至含相應抗生素的培養基中過夜培養,按2%接種比例轉接到新鮮培養基中發酵24 h后,菌液經12 000 r/min離心5 min收集上清液進行SDS-PAGE分析。

Rhv3蛋白序列C端添加有6個His-tag,作為純化標記。用AKTA中的HisTrap HP色譜柱純化Rhv3-His,蛋白純度用SDS-PAGE分析測定。

1.2.6 凝血酶滴定

蛋白濃度檢測采用BSA定量法。分別取0.5 mg/L蛋白標準溶液0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入到96孔酶標板中,用PBS溶液稀釋上述蛋白標準品溶液至終體積為20 μL。同時取適量樣品加入酶標板中,按需將終體積稀釋至20 μL;按照說明書配制BCA標準溶液,并向上述各孔中加入200 μL,放置在37 ℃培養箱中反應30 min;結束后使用酶標儀測定A595;最后根據蛋白標準品濃度及A595得出標準曲線,并按此曲線計算樣品蛋白濃度。

Rhv3活性分析采用凝血酶滴定法。試管中加入200 μL 0.5%(質量分數)牛纖維蛋白原及100 μL適量濃度發酵上清液;接著每隔1 min加入10 μL 50、25、12.5、6.25、3.125 NIH/mL凝血酶溶液,直至觀察到溶液出現凝結,此時即為反應終點。按照水蛭素與凝血酶1∶1反應,加入凝血酶的量即為水蛭素抗凝血酶活性(ATU/mL),如公式(1)所示:

(1)

2 結果與分析

2.1 Rhv3在C.glutamicum中的表達及活性分析

將構建好的p3A-M1-CspA-Rhv3-Chlr質粒(圖2-A)電轉化入C.glutamicumCGMCC 1.15647中進行發酵培養,取發酵上清液進行SDS-PAGE分析。結果如圖2-B所示,在15 kDa處出現明顯的蛋白條帶。與理論值(8 kDa)相比,目標條帶大小接近理論值的2倍,猜測可能是因為2個蛋白質分子間較強的疏水作用力使Rhv3以二聚體形式分泌。為進一步優化產量,將重組菌株分別在LBB、BHI和CGXⅡ 3種培養基中培養。結果顯示在CGXⅡ培養基中Rhv3幾乎無表達。結合重組菌株生物量及凝血酶滴定活性分析(圖2-C)可知,重組菌株在CGXⅡ培養基中生長最差,其OD600值僅為3.33,活性為0.42×103ATU/L。相反在BHI培養基中重組菌株具有最大的生物量(26.62)和最大活性(3.02×103ATU/L)。

A-單拷貝Rhv3質粒結構示意圖;B-不同培養基中Rhv3表達分析(M為分子質量標準);C-不同培養基中Rhv3活性分析

2.2 RBS篩選

為了獲得強RBS序列用于C.glutamicum中重組蛋白生產,本研究選取了7個不同強度的RBS序列,分別是AAAGGAGGA、AGAAGGAG、AGAAAGGAGG、GAAAGGAGG、GAAAGGA、GAAAGGCGA、GAAAGGAGA。按照圖1-A方式進行PCR,構建含不同RBS序列的p3A-RBS-egfp-Amp質粒。接著得到的質粒分別與p3A-Ptac-egfp-Kan進行組裝,構建兩拷貝egfp質粒(圖1-B)。將構建好的兩拷貝egfp質粒轉入C.glutamicum中,以單拷貝egfp(p3A-Ptac-egfp-Kan, POS)重組菌為對照(圖3-A),通過egfp熒光強度差異比較不同RBS序列表達強度。

A-兩拷貝egfp質粒結構示意圖;B-不同RBS重組菌株單位熒光強度(RFU/OD600值)比較

如圖3-B所示,兩拷貝egfp重組菌株熒光強度均高于單拷貝egfp重組菌株(POS);含不同RBS序列的兩拷貝egfp重組菌株中,RBS1熒光強度最高,達到POS的1.81倍;RBS2、RBS3次之;RBS5最弱,熒光強度與POS相比幾乎無增長。因此,選用RBS1序列用于C.glutamicum中重組蛋白的表達。

2.3 多拷貝Rhv3菌株構建及信號肽、拷貝數的優化表達分析

為優化Rhv3分泌水平,選擇C.glutamicum內源信號肽CgR0949、PorB、CspA、CspB、Cg1514進行Rhv3多拷貝重組菌株構建(圖4-A)并通過SDS-PAGE驗證其表達強度。以單拷貝Rhv3重組菌做對照,通過Image J進行灰度分析發現,兩拷貝Rhv3重組菌株表達量明顯得到改善,并且第二拷貝Rhv3使用CgR0949、PorB、CspA、CspB和Cg1514信號肽(M2S-Cg1514)時,分泌強度分別是單拷貝菌株(M1-CspA)的1.37、1.67、1.45、2.06、2.28倍。需要注意的是,當第二拷貝Rhv3使用信號肽CspA、CspB時,SDS-PAGE上顯示為兩條帶,猜測可能是蛋白表達過程中Rhv3蛋白出現降解造成的。

A-多拷貝Rhv3質粒結構示意圖;B～G-分別為二、三、四、五、六、七拷貝Rhv3表達分析(M-蛋白分子質量標準;CK-野生型C.glutamicum)

為進一步優化Rhv3的表達,選擇最優表達菌株(M2S-Cg1514)構建三拷貝Rhv3重組菌,結果如圖4-C所示,Rhv3最高表達強度(M3S-CspB)是M2S-Cg1514的1.45倍。當Rhv3拷貝數到六時,Rhv3表達量達到最高(M6S-PorB),是出發菌株的4.69倍(圖4-F)。然而在隨后的七拷貝Rhv3表達中發現,Rhv3表達量出現下降(圖4-G),猜測可能是過多重復序列積累導致其在體內發生同源重組;也可能是因為過多Rhv3合成消耗了過量核糖體,或者造成宿主代謝負擔加重,導致菌株生長不良。綜上,經過多輪構建及篩選,獲得了一株高產Rhv3重組菌株(M6S-PorB);并且發現,在一定程度上,Rhv3表達量隨著基因拷貝數的增加而升高。

2.4 Rhv3重組菌發酵培養及純化分析

將M6S-PorB重組菌在500 mL搖瓶中進行發酵培養并檢測其凝血酶活性。結果如圖5-A所示,菌株在4～20 h內生物量快速增長,20 h后進入穩定期,至40 h時生物量達到最高(OD600=23.08)。SDS-PAGE顯示,在4 h時上清液中能檢測到明顯的Rhv3蛋白條帶。并且隨著時間的延長,條帶越來越粗(圖5-B)。凝血酶滴定結果證實在40 h時,上清液中Rhv3活性達到最高,為10.91×103ATU/L,比單拷貝Rhv3菌株提高3.61倍。經BCA蛋白定量檢測分析可知,Rhv3含量達到1.89 g/L。AKTA純化后,Rhv3純度高于90%(圖5-C)。

A-重組菌株在BHI培養基中發酵生長曲線及Rhv3活性分析;B-重組菌株Rhv3表達分析(每泳道上樣3 μL,M為分子質量標準,1～12對應發酵4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h時Rhv3的表達情況);C-BSA標準曲線;D-經AKTA純化后蛋白的SDS-PAGE分析(L1為目標蛋白純化樣品)

3 討論

為了改善重組蛋白的合成,學者們嘗試過很多方法,包括替換啟動子和信號肽、共表達伴侶蛋白、優化發酵工藝、提高基因拷貝數等[13,16,18-19]。對于Rhv3這種小分子多肽的生產,多數采用多拷貝策略提高生產。LIN等[20]利用2A肽構建egfp基因多拷貝串聯表達菌株,egfp表達量在三拷貝時達到最高。梁偉鋒等[18]利用同尾酶的不可逆轉連接方式在Pichiapastoria中構建人腦源性神經營養因子(human brain derived neurotrophic factor, hBDNF)的1～6拷貝重組表達載體,使得hBDNF產量達到20 mg/L。同年,ZHONG等[21]使用常規構建方法在E.coli中構建1、2、4、8個拷貝融合人β-防御素-2(humanβ-defensin-2, hBD2)重組表達菌株,最終融合蛋白產量占總可溶性蛋白的62.2%,是目前報道的最高產量。周偉杰等[22]利用BioBrick法在P.pastoria中構建以Pgap為啟動子的五拷貝血管內表皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)重組菌,獲得VEGF165產量高達0.45 g/L。

理論上講,重組蛋白的生產與基因拷貝數呈線性關系,基因拷貝數增加會直接提高重組蛋白的生產。盡管在實際應用生產中被證實兩者并沒有呈現出很好的線性關系,但是這一策略仍然是提高重組蛋白生產最高效、快捷的方法。本研究通過在C.glutamicum中分泌表達Rhv3并篩選RBS、信號肽和拷貝數,使得Rhv3產量達到1.89 g/L。然而需要注意的是,RBS序列、拷貝數只是影響重組蛋白表達的因素之一,后續仍然可以通過底盤細胞改造、發酵工藝優化等手段進一步改善Rhv3的表達。

4 結論

總之,本研究在C.glutamicum表達系統中開發了3A組裝的多拷貝基因表達策略。利用該策略,優化Rhv3合成過程中的RBS、信號肽以及拷貝數等,在放大培養中Rhv3分泌活性達到10.91×103ATU/L,比之前報道的1.75×103ATU/L[16]提高523%。與通過Linker、2A肽等進行重組蛋白表達的多拷貝融合策略相比,本研究多拷貝基因策略旨在利用一條mRNA上進行多個核糖體結合位點的翻譯,實現重組蛋白表達最大化。同時3A組裝的開發,縮短了載體構建周期,極大加速了重組蛋白生產效率。這一策略的開發,增強了C.glutamicum作為重組蛋白生產宿主的核心競爭力,為進一步利用C.glutamicum進行重組蛋白工業化生產奠定了基礎。