液相色譜-串聯質譜測定洋蔥中的五種前列腺素

任興權,周麗,張海霞,章學良,趙俊,霍文清,陶璐,劉盼*

1(酒泉市食品檢驗檢測中心,甘肅 酒泉,735000)2(蘭州大學 化學化工學院,甘肅 蘭州,730000) 3(沈陽農業大學 食品學院,遼寧 沈陽,110161)

前列腺素(prostaglandin,PG)是一類有生理活性的不飽和脂肪酸,由五環及側鏈構成的二十碳花生四烯酸脂肪酸,按其結構分為A、B、C、D、E、F等類型。人體的很多組織細胞都可以產生,但是最先是從人的精液中發現的,當時以為是由前列腺釋放的,所以命名為前列腺素。PG參與了人體很多的生命活動,尤其是在生理和病變的調節方面。在環氧酶的作用下,前列腺受體相互作用,在機體組織中維持血管、胃、腸道、腎臟等的生理穩態平衡,還可以調節女性生殖及分娩。尤其在血管疾病調節方面發揮著重要作用,可以有效調節血壓、血管重構、消除炎癥等。近些年來通過臨床試驗發現,PG可以有效治療眼部淋巴管疾病、治療糖尿病下肢血管病變、預防新生兒黃疸、預防高危妊娠剖宮產產后出血、治療老年失代償期乙型肝炎肝硬化、治療腫瘤免疫、治療男性勃起功能障礙、預防老年冠心病患者介入治療后造影劑腎病、治療骨關節炎。

洋蔥(AlliumcepaL.) 是百合科蔥屬多年生草本植物,又稱為蔥頭、圓蔥、球蔥、玉蔥,中國南北均有廣泛栽培[1]。由于所在產地的氣候環境、土壤以及種植品種等因素的影響,所產洋蔥的品質各異。洋蔥中含有前列腺素、槲皮素、大蒜素、丙基二硫等硫化物[2]、黃酮類[3-4]、蒜氨酶[5]等酶類、皂苷物[6]、含氮化合物[7]、糖類[8]等多種活性成分。尤其,洋蔥是極少數富含PG的蔬菜之一[9]。洋蔥中的PG主要包括前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a等[10],能降低外周血管阻力,降低血黏度,具有降低血壓[11-12]、提神醒腦、抗炎、抗氧化、殺菌、降血糖、緩解壓力、預防感冒、心腦血管疾病等作用[13-14]。目前,對洋蔥活性成分的研究主要集中在黃酮、多糖、含硫化合物等[15-16],PGAl更多被應用于臨床治療[17],而對洋蔥中的PG的研究比較少,尤其對洋蔥中前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a含量尚不清楚。

目前已報道的對洋蔥中前列腺素A1的含量檢測主要是HPLC法[18-20],對注射液中前列腺素A1的檢測方法有采用LC-MS/MS法[21],對洋蔥中PG的其他4種主要成分(前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a)的檢測以及這5種PG同時檢測的相關方法沒有報道。王曉婷等[1]將新鮮洋蔥50 ℃干燥后用甲醇超聲提取后,采用超高液相色譜以七氟丁酸水溶和甲醇為流動相在254 nm波長處檢測了云南、黑龍江兩地洋蔥中的前列腺素A1。常海民等[19]采用高效液相色譜法柱后衍生在278 nm波長處對直接稀釋的前列地爾注射液中的前列腺素A1進行了檢測。趙曉玲等[20]用RP-HPLC對前列地爾尿道栓中的前列腺素A1和前列腺素E1在210 nm波長處進行檢測。曹晴等[21]采用LC-MS/MS對前列地爾注射液加入5 μg/mL地塞米松溶液內標溶液后檢測前列腺素A1?，F已報道的HPLC法和LC-MS/MS法檢測PG普遍存在的問題是提取效果不理想,檢測的準確性不高,并且也只是對前列腺素A1和前列腺素E1進行了研究分析,并沒有對前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素F1a的檢測進行研究。

本研究用乙醇溶液將洋蔥浸泡提取,用旋轉蒸發儀濃縮后用甲醇+乙腈(1+1)混合溶液定容,對前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a的全掃描監測MRM條件研究,建立了提取效果良好、科學準確的液相色譜-串聯質譜同時測定洋蔥中5種PG的方法。通過與現有文獻方法對比,本方法前處理簡便、靈敏度高、重現性好,能科學準確地分析分析檢測洋蔥中的前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a含量,對洋蔥的深加工研究具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥,市購。

甲醇、乙腈(HPLC),賽默飛fisher公司;乙醇(HPLC)、七氟丁酸、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水乙酸鈉、無水乙酸鎂(AR),國藥集團化學試劑有限公司;甲酸銨、乙酸銨(均為for LC-MS,≥99.0%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;前列腺素A1(C20H32O4,CAS號:14152-28-4,純度≥99.9%)、前列腺素A2(C20H30O4,CAS號:13345-50-1,純度≥99.9%)、前列腺素B1(C20H32O4,CAS號:13345-51-2,純度≥99.9%)、前列腺素E1(C20H34O5,CAS號:745-65-3,純度≥99.9%),TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC;前列腺素F1a(C20H34O6,CAS號:58962-34-8,純度≥99.9%),Avanti POLAR LIPIDS INC.。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6460電噴霧-串聯四極桿質譜儀,美國Agilent公司;A2S-T-1024-BE型超純水機,美國艾科浦國際有限公司;KH-600型超聲波清洗機,昆山禾創超聲儀器有限公司;GL21M型高速冷凍離心機,長沙英泰儀器有限公司;Vortex-Genie2型渦旋混合器,美國Scientific Industries公司;MS105型十萬分之一電子天平,瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司;Quintix2 102-1CN型百分之一電子天平,德國賽多利斯公司;RE100-Pro型旋轉蒸發儀, 大龍興創實驗儀器(北京)股份公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 液相色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱(1.8 μm,50 mm×2.1 mm);流動相A:5 mmol/L甲酸銨溶液,流動相B:甲醇+乙腈(1+1)混合溶液。梯度洗脫:0.0～1.0 min,60% A,1.0～2.0 min,30% A;3.0～4.0 min,10% A,4.0～6.0 min,2% A;6.0～7.0 min,60% A。流速:0.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:2 μL。

1.3.2 質譜條件

離子源類別:電噴霧離子源;掃描方式:負離子掃描;電噴霧電壓:-3 500 V;離子源溫度:200 ℃;霧化氣:15 psi;多反應監測:每種前列腺素物質選擇2個子離子。

1.3.3 標準曲線溶液的配制

分別稱取1 mg前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇+乙腈(1+1)混合試劑溶解并定容,配制成100 μg/mL的標準溶液;用甲醇+乙腈(1+1)混合試劑稀釋成5、10、20、50、100、200 ng/mL的標準系列混合溶液。

1.3.4 試樣制備及提取

使用制樣機將樣品破碎并均質,裝入無菌密封袋中并標識,放于-18 ℃環境中存放。

稱取樣品10.00 g于50 mL具塞離心管中,加入20.0 mL乙醇渦旋2 min,之后,加入8.5 g無水硫酸鎂后再次渦旋2 min。在高速冷凍離心機中,設置3 ℃條件下以12 000 r/min的轉速,離心5 min。吸取乙醇層于100 mL旋轉蒸發瓶中旋轉蒸發至近干,用甲醇+乙腈(1+1)混合溶液溶洗到5 mL容量瓶中,過0.22 μm有機系濾膜后上機測定。

1.3.5 定性、定量方法

以前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a保留時間定性,以外標法對前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 提取方式的選擇

洋蔥中前列腺素A1的文獻報道提取方法為甲醇超聲提取,前列地爾尿道栓中的前列腺素A1用直接用甲醇稀釋提取,也有在前列地爾尿道栓中的前列腺素A1加甲醇、30%(體積分數)過氧化氫、0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液提取,通過綜合以上方法的基礎上,進一步對甲醇+30%過氧化氫+0.1 mol/L氫氧化鈉、乙腈法、甲醇法、甲醇+乙腈法、乙醇法實驗對比,實驗結果表明提取效果均不理想,達不到完全提取。本研究方法在先加入乙醇提取后,再加入無水乙酸鎂吸收水分,在高速冷凍離心機上離心后在旋轉蒸發儀上蒸發近干,最后用甲醇+乙腈復溶。通過對各種方法的試驗,表明乙醇能夠有效地提取PG,無水乙酸鎂的吸水性比較強,能夠最大程度吸取樣品中的水分。高速冷凍離心機上離心和旋轉蒸發儀低壓低溫濃縮,可以有效提取洋蔥中的PG。對同一樣品等量稱取30份,分別用以上文獻報道的方法及本方法處理提取后分析,每一方法處理的樣品平行提取進樣5次,以上方法及本實驗的PG總量標準差分別為0.68、0.59、0.61、0.52、0.42、0.30,其各方法對PG的相對提取率見圖1。通過試驗結果表明本法明顯優于已報道的提取方法。

圖1 不同方法的提取效果

2.2 儀器條件的選擇

2.2.1 質譜條件的選擇

分別通過對前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a的正模式和負式掃描,發現5種PG均在負模式狀態下失去1個H有最大響應信號,在掃描得出最佳裂解電壓后分別掃描得出每種PG的子離子,同時并對裂解電壓和碰撞能進行了優化選擇。在負離子模式下,對前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a進行母離子和子離子掃描,優化的質譜參數見表1。

表1 前列腺素PGA1、PGA2、PGB1、PGE1、PGF1a的質譜參數

2.2.2 色譜柱的選擇

分別對Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱(1.8 μm,50 mm ×2.1 mm)、ZORBAX Eclipse XDB-C18 (1.8 μm,50 mm×2.1 mm)、ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm,100 mm×3 mm)、COTECS Shield RP18 (2.7 μm,100 mm×2.1 mm)、AtlantisTMT3(5 μm,50 mm×2.1 mm)5種色譜柱進行了對比,前列腺素A1、前列腺素A2、前列腺素B1、前列腺素E1、前列腺素F1a在Agilent Eclipse Plus C18 RRHD(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱上相較于其他4種色譜柱的分離效果好,主要是穩定性好,分析速度快,分離效率高,靈敏度和柱效高。

2.2.3 流動相體系的選擇

根據前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的物質特性,分別對七氟丁酸甲醇水溶液、乙腈水溶液、甲醇水溶液、5 mmol/L乙酸銨甲醇溶液、5 mmol/L甲酸銨甲醇溶液、5 mmol/L乙酸銨乙腈溶液、5 mmol/L甲酸銨乙腈溶液、5 mmol/L甲酸銨溶液+甲醇+乙腈、5 mmol/L 乙酸銨溶液+甲醇+乙腈等流動相體系在分析檢測前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的分離效果進行了實驗考察,試驗表明5 mmol/L甲酸銨溶液+乙腈+甲醇為流動相體系時色譜的分離達到了最好的效果。

2.2.4 流動相淋洗方式的選擇

對常規的淋洗方式進行了試驗比對,前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)5種物質在采用等度淋洗時無法分離開來,出現了色譜峰重疊的現象。試驗表明梯度淋洗比等度淋洗的分離效果好,并且試驗驗證當為流動相A為5 mmol/L甲酸銨溶液,流動相B為甲醇+乙腈(1+1)混合溶液,程序0.0～1.0 min,60% A;1.0～2.0 min,30% A;3.0～4.0 min,10% A;4.0～6.0 min,2% A;6.0～7.0 min,60% A梯度洗脫時分離效果最佳。

2.2.5 流動相流速的選擇

在0.10～0.50 mL/min內分別設置不同的流速,對其不同流速的分析結果進行比較。試驗表明,流速越大,保留時間越短,5種前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的保留時間越接近。綜合柱效、保留時間、分離度、分析檢測效率、響應值等因素,流動相流速為0.2 mL/min時適宜。在本方法的條件下,前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的多反應監測色譜圖見圖2～圖6。

a-多反應監測定量離子提取圖;b-多反應監測質量色譜圖

a-多反應監測定量離子提取圖;b-多反應監測質量色譜圖

a-多反應監測定量離子提取圖;b-多反應監測質量色譜圖

a-多反應監測定量離子提取圖;b-多反應監測質量色譜圖

a-多反應監測定量離子提取圖;b-多反應監測質量色譜圖

2.3 標準曲線與檢出限

方法的標準曲線以物質量濃度(X,ng/mL)為橫坐標、離子響應強度值(Y)為縱坐標,前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的線性方程及其相關系數見表2,在濃度5.0～200 ng/mL內,前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的線性相關系數(R2)為0.999 7～0.999 9,完全符合儀器定量分析的要求。

表2 前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的保留時間、線性方程、相關系數(R2)

在空白基質新鮮洋蔥中加入前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a),按照本方法進行提取和分析,以3倍、10倍信噪比計算得到本方法中前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的檢出限均為1.0 μg/kg,定量限均為2.5 μg/kg。和報道的分析方法相比,本方法的靈敏度較高。

2.4 回收率和精密度

向已分析檢測前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)含量的洋蔥中分別添加10.0、20.0、40.0 ng/mL低、中、高3個濃度水平的前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)混合標準溶液,按照本方法進行前處理和分析檢測,對每個加標樣品在相同條件下平行分析6次,加標回收率為96%～109%,相對標準偏差為0.26%～1.81%,具體結果見表3,試驗表明,本方法的準確度和精密度較高,對洋蔥中的前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)能夠進行準確的分析檢測。

表3 前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的回收率和精密度

2.5 基質效應評價

通過對洋蔥的篩選,選出均未檢出前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的洋蔥作為樣品基質,向樣品基質中加入5種PG的混合標準溶液,按照1.3.4節提取,配制成同1.3.3節一樣的5～200 ng/mL的標準系列混合溶液,線性相關系數(R2)均也在0.999 7～0.999 9。同時,在樣品基質中分別添加10.0、20.0、40.0 ng/mL 3個質量濃度水平,加標回收率為96%～106%,并且對加到樣品基質中的標準溶液與相對應的未加到基質中的標準溶液的響應強度進行對比,相對標準偏差為0.32%～0.96%。通過實驗表明在對洋蔥中5種PG的分析檢測中基質效應的影響非常小。

2.6 洋蔥樣品分析

采用本方法對任意選取的洋蔥外層皮、中心部、根部樣品中前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)進行分析檢測,結果洋蔥外層皮中前列腺素的總含量為68.6 μg/kg,洋蔥中心部前列腺素中的總含量為66.2 μg/kg,洋蔥根部前列腺素的總含量為60.8 μg/kg,從分析檢測結果可知,洋蔥中的前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)含量是非常低的,從洋蔥外層皮、中心部、根部依次降低。

2.7 與已報道方法的對比

分別用本方法和已報道的王曉婷等[1]將新鮮洋蔥50 ℃干燥后用甲醇超聲提取后,采用超高液相色譜檢測洋蔥中前列腺素A1的分析檢測方法對白洋蔥、紫洋蔥、黃洋蔥中的前列腺素(PGA1)處理及分析檢測,具體分析檢測的結果見表4,很明顯本方法測得的含量比報道方法測得的含量高得多,同時在紫洋蔥中添加20 ng/mL濃度水平的PGA1標準溶液后前處理及分析檢測,本方法的加標回收率為97%,報道文獻方法的加標回收率為69%,通過試驗證明本方法更優于已報道的方法。因為前列腺素(PGA2、B1、E1、F1a)的分析檢測暫時目前無報道的方法,無法進行對比。

表4 本方法與報道方法檢測結果的對比

3 結論

本研究建立了液相色譜-串聯質譜分析檢測洋蔥中的前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的方法。用乙醇提取后,再加入無水乙酸鎂吸收水分,在高速冷凍離心機上離心后在旋轉蒸發儀上蒸發近干,最后用甲醇+乙腈復溶,在電噴霧負離子模式下,采用四級桿質譜儀進行多反應分析。與現有報道的方法相比,本法科學、準確、全面、操作簡便,非常適合洋蔥中的前列腺素(PGA1、A2、B1、E1、F1a)的分析研究,對于洋蔥的功能性成分分析研究和深加工產業發展提供一定的技術支撐,對保障農民增收、促進鄉村振興具有重要的實際意義。