基于蓮藕提取物生物合成納米銀及其抑菌活性研究

吳承宗,魏亞楠,戴昕彤,苗雨穎,黃婷,趙康輝,王磊*,宿紅艷

1(魯東大學 生命科學學院,山東 煙臺,264025)2(魯東大學 農學院,山東 煙臺,264025)

蓮藕(NelumbonuciferaGaertn)為睡蓮科蓮屬,多年水生草本植物,其地下根狀莖是我國最主要的水生蔬菜[1]。蓮藕富含蛋白質、淀粉、纖維素、脂肪、維生素、礦物質等多種成分,其中淀粉含量很高,占其鮮重的10%～20%[2]。另外,蓮藕中還含有豐富的槲皮素、蘆丁等黃酮類物質以及原花色素、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、白藜蘆醇等多酚類物質[3-4]。因此,蓮藕具有很強的清除自由基和抗氧化能力,是提取天然抗氧化劑的優良原料。

近年來,抗生素等抑菌劑的長期濫用導致多重耐藥性細菌不斷產生,臨床治療和水產養殖等抑菌領域面臨無藥可用的局面[5]。隨著納米技術的不斷發展,具有小尺寸和高比表面積的納米銀(silver nanoparticles,AgNPs)被廣泛用于抑菌領域[6]。AgNPs抗菌譜廣、抑菌效果顯著、生物安全性高,更為重要的是其抑菌機制與傳統抗生素不同,不易產生耐藥性,被譽為新一代的抗菌劑[7-8]。AgNPs的經典合成方法為物理學方法和化學方法,但這兩種方法存在諸多弊端,如對儀器要求高、能耗大、需要添加有害化學試劑、產品粒徑較大且分布范圍寬泛等,這勢必會影響AgNPs的批量生產與開發利用[9-10]。另外,AgNPs易發生團聚,導致抑菌活性降低,也極大的限制其在抑菌方面的實際應用[11]。一項生物合成AgNPs的新技術是利用植物、藻類、細菌和真菌等生物中的活性成分作為還原劑將AgNO3前體轉化成AgNPs制劑,同時利用生物提取物中的活性分子作為穩定劑在AgNPs表面形成保護層,阻止AgNPs的團聚和沉降[6,12]。該方法綠色環保、原料價格低廉、產品高效穩定,符合新技術向低成本、低能耗、低污染發展的趨勢[6,13]。在諸多生物材料中,植物材料以其生物量大、便于采集加工、便于中試放大等優勢成為生物合成AgNPs技術中一個重要的研究領域。目前,人們已利用生姜、藍莓葉、橄欖和迷迭香等多種植物材料介導AgNPs的生物合成[14-15],并取得了良好的效果。但由于不同的植物材料中蘊含的活性物質存在較大差別,其制備的AgNPs在形狀、大小及其表面附著的生物分子方面都存在較大差異,導致其在抑菌活性和穩定性等方面存在差異[16]。因此,篩選并挖掘新的植物材料用于制備更為理想的AgNPs抑菌劑將成為納米生物技術重要的研究內容。

本文利用蓮藕中富含的多種天然抗氧化成分為還原劑,同時利用提取液中的多糖、氨基酸、蛋白質等作為穩定劑,生物合成AgNPs抑菌劑。通過探討不同合成條件對制備AgNPs的影響,并對優化后的產物進行理化表征以及抑菌活性和穩定性分析,為提升蓮藕的綜合利用度和附加值提供新的途徑,同時為生物合成AgNPs的推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

蓮藕購于山東省煙臺市當地超市。

4種臨床病原菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli);4種水產病原菌:副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、點狀氣單胞菌(Aeromonaspunctata)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi),均由本實驗室保藏。

1.2 試劑與培養基

NaCl、AgNO3,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;酵母提取物、蛋白胨、瓊脂,上海生工生物工程有限公司。

LB固體培養基(g/L):酵母提取物5,蛋白胨10,氯化鈉5,瓊脂粉15,pH值調至7.4,120 ℃高壓滅菌20 min;以上成分不加瓊脂粉配制成LB液體培養基。用于臨床病原菌的培養。

2216E固體培養基:蛋白胨5 g,酵母膏1 g,磷酸高鐵0.01 g,瓊脂粉15 g,陳海水定容至1 000 mL,用1 mol/L的NaOH調節pH值至7.6～7.8,120 ℃高壓滅菌20 min;以上成分不加瓊脂粉配制2216E液體培養基。用于水產病原菌的培養。

1.3 儀器與設備

LDZX-50FB型高壓滅菌鍋,上海申安醫療器械有限公司;SW-CJ-2F型超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;HZQ-C型恒溫培養搖床,哈爾濱東明醫療儀器廠;PYX-DHS型恒溫培養箱,上海躍進醫療器械廠;U-5100型紫外-可見分光光度計,日本日立公司;JEM-1230型透射電子顯微鏡,日本電子株式會社;XRD-7000 型X射線衍射儀,日本島津公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 AgNPs的生物合成

蓮藕提取液的制備:取完整的蓮藕塊莖用去離子水洗凈,60 ℃烘干,研磨成粉末。稱取5 g,用50 mL 40%(體積分數)乙醇提取,經60 ℃加熱回流2 h后,提取液提取物用Whatman No.1濾紙過濾,再經10 000 r/min離心10 min后,收集上清液,4 ℃備用。

AgNPs的制備為了優化合成條件,設計單因素試驗。初始條件為:將2 mL 10 mmol/L的AgNO3溶液與上述蓮藕提取液1 mL混合,定容至20mL,在磁力攪拌下90 ℃加熱回流1 h,12 000 r/min離心10 min,收集沉淀,用雙蒸水重懸,得到AgNPs溶液,4 ℃避光保存。單因素試驗反應條件:其他條件不變的情況下,分別改變AgNO3濃度(0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mmol/L)、提取液用量(0.25、0.5、1、2、3 mL)、合成溫度(50、60、70、80、90 ℃)、合成時間(3、5、7、10、15、20、30 min)。

1.4.2 AgNPs的化學合成

為了評價蓮藕生物合成AgNPs的效果,利用檸檬酸鈉為還原劑化學合成AgNPs[17]。AgNO3濃度、合成溫度、合成時間等實驗條件均采用上述生物合成AgNPs的最終優化參數,蓮藕提取液用2 mg/mL的檸檬酸鈉代替。

1.4.3 AgNPs表征

紫外-可見吸收光譜分析:采用UV-Vis分光光度計對制備的AgNPs溶液進行吸收光譜掃描,掃描范圍為300～800 nm。

透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)分析:取5 μL樣品滴加在覆炭銅網上,室溫干燥,于100 kV電壓下觀察制備AgNPs的形態、粒徑及分散狀況。

X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)分析:通過XRD分析儀以Cu、Kα為輻射源,λ=0.154 06 nm,電壓40 kV,電流200 mA,2θ的掃描范圍30°～80°,掃描速度0.02°/s,對樣品干燥粉末進行的晶型結構分析。

1.4.4 抑菌性實驗

抑菌圈實驗:采用牛津杯擴散法檢測AgNPs對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等臨床病原菌以及副溶血弧菌、鰻弧菌、點狀氣單胞菌和哈維氏弧菌等水產病原菌的抑菌活性。采用牛津杯擴散法測定供試樣品的抑菌圈直徑[18],分別向牛津杯中依次加入20 μL生物合成AgNPs(100 μg/mL)、化學合成AgNPs(100 μg/mL)、檸檬酸鈉(2 mg/mL)、蓮藕提取液和生理鹽水,每組設置3個平行。將培養平皿置于恒溫培養箱中培養24 h,測量抑菌圈直徑。

最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)的測定:以金黃色葡萄球菌為指示菌,將培養至對數期的菌液稀釋至1×106CFU/mL,將化學合成AgNPs和生物化學合成AgNPs調整至同一濃度,采用二倍稀釋法測定其MIC和MBC[18],實驗各重復3次。

抑菌動力學實驗:以金黃色葡萄球菌作為指示菌,培養至對數增長期后稀釋至1×106CFU/mL,分別加入10 μg/mL和25 μg/mL的生物合成AgNPs、10 μg/mL的化學合成AgNPs,并以加入生理鹽水的供試菌組為對照,37 ℃ 150 r/min培養,在0～36 h中的各個時間段內取樣,采用分光光度計測定OD600值,繪制生長動力學曲線。

1.4.5 穩定性實驗

長期穩定性實驗:將生物合成和化學合成的AgNPs在4 ℃避光條件下放置2個月后觀察其外觀,通過UV-Vis分光光度計檢測AgNPs的吸收光譜,并以金黃色葡萄球菌作為指示菌進行抑菌圈實驗,研究其長期穩定性。

熱穩定性實驗:分別將化學和生物合成的AgNPs在50、70、90 ℃下熱處理3 h,以金黃色葡萄球菌為供試菌進行抑菌圈實驗,觀察熱處理對AgNPs的影響。

1.5 數據統計分析

使用Origin軟件進行數據統計與分析,采用單因素方差(ANOVA)對數據進行顯著性分析(P<0.05)。所有實驗數據均測定3次,結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 AgNPs制備參數優化

由圖1-a可知,AgNPs吸收峰隨著AgNO3濃度增加逐漸升高。當濃度由0.75 mmol/L變為1 mmol/L時,吸收峰有顯著升高并且峰形變窄,但當AgNO3濃度繼續增加時,吸收峰無明顯提高。典型的AgNPs由于特征性的表面等離子體共振,在波長400～500 nm有強吸收,出現特征吸收峰[19]。因此,根據UV-vis光譜可以推斷蓮藕生物合成AgNPs的最佳AgNO3濃度為1 mmol/L。

a-AgNO3濃度的影響;b-蓮藕提取液添加量的影響;c-反應溫度的影響;d-反應時間的影響

研究蓮藕提取液加入量對AgNPs合成的影響,結果如圖1-b所示,隨著蓮藕提取液加入量的增加,AgNPs的最大吸收峰逐漸增強。當提取液加入量為0.25、0.5 mL時,吸收峰較寬,當蓮藕提取液加入量為1 mL時,半峰寬減小,說明AgNPs顆粒的粒徑分布變窄[20]。當蓮藕提取液加入量為2 mL時,最高吸收峰由436 nm移至458 nm,發生紅移,吸收峰變寬,這表明隨著AgNPs生成的增加,部分AgNPs發生團聚,粒徑變大,粒徑大小不均一[21]。當提取液加入量增至3 mL后,吸收峰進一步紅移,峰形因粒徑不均勻分布變得不對稱。因此,提取液濃度不宜過高,蓮藕提取液加入量以1 mL為宜。

合成溫度對AgNPs合成的影響結果如圖1-c所示,隨著溫度增加AgNPs的吸收峰逐漸上升,溫度越高,反應速率越快。當加熱溫度升至70 ℃時,AgNPs吸收峰有顯著提高,且峰形變窄且高,最高吸收峰由442 nm發生藍移至434 nm,說明此溫度下合成效率較高,合成的AgNPs顆粒較小、粒徑較為均勻[22]。加熱溫度為80 ℃時,AgNPs峰值無明顯改變,但在90 ℃時吸光度值卻呈現下降的趨勢。這是由于當溫度升高的一定程度后,溶液中AgNPs粒子布朗運動聚類加劇,大量AgNPs撞擊產生聚集沉淀,導致溶液中AgNPs的濃度降低[23]。因此,蓮藕生物合成AgNPs的最佳合成溫度確定為70 ℃。

反應時間對AgNPs的影響結果如圖1-d所示,反應進行5 min時開始出現AgNPs吸收峰,隨著反應時間的增加吸收峰逐漸升高,反應進行30 min時吸收峰值較高且吸收峰較窄,表明合成的AgNPs狀態較為理想。若繼續延長加熱時間,納米銀溶液的顏色和吸收峰在短期內均不再發生顯著變化,因此確定30 min為生物合成AgNPs的反應時間。

綜上所述,蓮藕提取液生物合成AgNPs的最佳制備條件為1 mmol/L 的AgNO3,1 mL的蓮藕提取液,70 ℃加熱回流30 min。

2.2 AgNPs的表征分析

2.2.1 紫外吸收光譜

對最佳合成條件制備的AgNPs進行顏色觀察和紫外-可見吸收光譜表征,AgNPs因濃度和粒徑大小的不同在等離子共振下呈現金黃至棕褐色的特征顏色,并形成特征吸收光譜[24]。由圖2-a可知,蓮藕提取液為無色透明,合成產物為金黃色,可初步判定AgNPs的產生。由圖2-b可知,AgNPs在432 nm左右顯現出顯著的特征吸收峰,而蓮藕提取液無吸收峰,進一步驗證了AgNPs的成功制備。

a-照片;b-紫外-可見吸收光譜

2.2.2 TEM分析

AgNPs的粒徑、形貌和分散性可以使用TEM直接有效地觀察。如圖3-a所示,AgNPs多為球形,粒徑均勻,分散狀態良好,無明顯團聚。AgNPs粒徑范圍在2～21 nm,平均粒徑為8.2 nm,58%的AgNPs粒徑為10 nm左右,粒徑分布較為集中(圖3-b)。研究表明AgNPs的抑菌活性與其粒徑呈反比,粒徑越小,比表面積越大,越有利于更多的AgNPs結合并穿透細菌細胞膜,發揮抑菌作用[25]。本研究方法制備的AgNPs粒徑較小,適于開發成抑菌劑。

a-透射電鏡照片;b-粒徑分布圖

2.2.3 XRD分析

通過XRD對生物合成AgNPs的晶型結構進行表征,XRD圖譜如圖4所示。制備的AgNPs在2θ角為38.16°、44.36°、64.56°和76.80°的4個位置產生明顯衍射峰,依次與標準銀晶態的(111)、(200)、(220)和(311)的晶面相對應(參照JCPDS卡編號04-0783),表明生物合成的AgNPs具有面心立方晶型結構。此外,產物還在32.32°、46.36°、54.96°、57.68°和74.60 °等位置(*標注)有AgCl的衍射峰(參照JCPDS卡編號31-1238),是因為蓮藕提取液中存在Cl-與AgNO3發生反應導致的,這在其他關于AgNPs生物合成的研究中很常見[26]。

圖4 納米銀的XRD圖譜

2.3 抑菌活性實驗

2.3.1 抑菌圈實驗

采用瓊脂擴散法檢測AgNPs對8種典型多重耐藥病原菌的抑菌效果。由圖5可知,作為對照的檸檬酸鈉、蓮藕提取液和生理鹽水對應的牛津杯中仍有菌落生長,表明這3種物質不具備抑菌活性。生物合成AgNPs和化學合成AgNPs對8種耐藥菌均產生明顯的抑菌圈,表明AgNPs具有廣譜抑菌活性。結合表1可知,生物合成和化學合成的AgNPs產生的抑菌圈因病原體的不同而產生差異,表明病原菌的不同導致對抑菌劑敏感度的差異性。另外,生物合成AgNPs比化學合成AgNPs產生的抑菌圈直徑更大,表明生物合成的AgNPs具有更強的抑菌活性。研究表明,AgNPs大的比表面積容易附著在細菌細胞膜上,并具有超強的滲透性可迅速進入菌體中,使細菌細胞膜破裂、內容物泄露[27-28]。AgNPs還可與氧代謝酶的巰基結合,使酶失活,阻斷呼吸代謝,并干擾DNA復制,使細菌停止分裂增殖[29]。AgNPs獨特而多重的殺菌機制,使其對普通細菌、耐藥細菌及真菌均有良好的殺菌作用。

表1 納米銀對8種病原菌的抑菌圈直徑(n=3)

1-生物合成AgNPs;2-化學合成AgNPs;3-檸檬酸鈉;4-蓮藕提取液;5-生理鹽水

2.3.2 MIC和MBC測定

以金黃色葡萄球菌為供試菌,采用二倍稀釋法測定AgNPs的MIC和MBC。3次重復實驗結果均一致,如表2所示,當蓮藕生物合成AgNPs質量濃度大于11.25 μg/mL時,試管內的溶液開始渾濁,則11.25 μg/mL即為該生物合成AgNPs的MIC。澄清試管內的菌懸液分別取100 μL涂布于LB固體培養基上,培養24 h后記錄平板內菌落的生長情況,最終確定22.5 μg/mL為生物合成AgNPs的MBC?；瘜W合成法制備的AgNPs的MIC和MBC分別為22.5、45.0 μg/mL。由此可見,與化學合成AgNPs相比,蓮藕生物合成AgNPs具有較高的抑菌和殺菌活性,這與KORA等[30]利用橄欖生物合成AgNPs的研究結果一致?；瘜W合成的AgNPs在粒徑小于40 nm或者濃度較高的情況下容易發生團聚、沉淀,使AgNPs抑菌活性降低。而生物合成AgNPs由于其表面有生物分子的結合,保持較好的分散狀態,從而維持較大的比表面積和抑菌活性[6]。

表2 納米銀對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

2.3.3 生長曲線

細菌的增殖速度可以由細菌培養液的吸光值反映,以金黃色葡萄球菌為指示菌,研究生物合成AgNPs的不同濃度對金黃色葡萄球菌的抑制作用。從圖6中可看出,對照組為細菌的正常增殖速度:1.5 h之前為延滯期,1.5 h之后金黃色葡萄球菌進入對數增長期,12 h以后其進入穩定期。在高于MBC下,25 μg/mL 的生物合成AgNPs對金黃色葡萄球菌的增殖完全抑制,36 h內該處理組菌液的OD值基本沒有波動。10 μg/mL的生物合成AgNPs和10 μg/mL的化學合成AgNPs可以將金黃色葡萄球菌的遲滯期由1.5 h分別延長到9 h和6 h,這說明兩種AgNPs都能對供試菌產生抑制作用,其中生物合成AgNPs可將金黃色葡萄球菌對數增長期的滯后時間更長,并使分裂速率下降,比化學合成AgNPs具有更強的抑菌效果,與抑菌圈實驗和MIC實驗的結果相一致。

圖6 納米銀對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

2.4 穩定性分析

2.4.1 長期穩定性分析

生物合成的AgNPs溶液在低溫避光環境下保存60 d后,沒有沉淀,顏色無明顯變化;化學合成的AgNPs溶液有沉淀生成。進一步UV-vis分光光度計表征,結果如圖7所示,表明生物合成的AgNPs在放置2個月后其吸收峰略有下降,但峰形依舊較窄,表明該AgNPs沒有團聚,粒徑均勻分布,具有良好的穩定性。而化學合成的AgNPs的最大吸收峰發生了明顯紅移,并且吸光度明顯下降,表明團聚沉淀造成溶液中AgNPs含量的下降。

a-化學合成的AgNPs;b-生物合成的AgNPs

2.4.2 抑菌活性的耐熱穩定性分析

將AgNPs在50、70、90 ℃ 3種不同溫度下分別熱處理3 h,再通過對金黃色葡萄球菌的抑菌圈實驗檢測AgNPs的熱穩定性。圖8結果顯示,經過3種不同溫度熱處理后的AgNPs均有較大的抑菌圈,進一步說明AgNPs具有較好的熱穩定性。其中70 ℃處理后的AgNPs的抑菌圈直徑最大,相關研究表明,溫度升高會增加分子的熱運動,從而促進AgNPs粒子的擴散[27]。

1-50 ℃處理AgNPs;2-70 ℃處理AgNPs;3-90 ℃處理AgNPs;4-常溫蓮藕提取液對照;5-常溫生理鹽水對照

化學還原法因設備簡單、成本低廉的優勢成為目前制備AgNPs的主要方法,但Ag+因其納米尺寸而具有很高的表面能,當AgNPs粒徑小于40 nm或者濃度較高時,粒子間的布朗運動會導致AgNPs易發生沉降團聚[19]。因此,穩定性差成為化學法制備AgNPs制劑的短板,也成為AgNPs抑菌劑開發利用的重要障礙。上述穩定性實驗表明,利用蓮藕生物合成AgNPs能夠顯著提高AgNPs的穩定性,具有良好的開發前景。

3 結論

本研究成功利于蓮藕提取物通過一步法生物合成AgNPs抑菌劑,經70 ℃加熱回流30 min即可完成反應,合成迅速高效、綠色環保,表明利用蓮藕提取物生物合成AgNPs具有可行性。實驗結果表明制備的AgNPs粒徑較小且均勻、分散性良好。對供試的臨床和水產耐藥病原菌均具有顯著的抑菌活性,且抑菌活性的耐熱穩定性良好,并具有較好的長期穩定性。因此,利于蓮藕提取物生物合成的AgNPs是一種理想的抑菌產品。AgNPs因抑菌效果顯著、抗菌廣譜、無耐藥性等優點,已作為抗生素的替代品成為抑菌領域的研究熱點。本研究將為AgNPs的綠色合成及蓮藕的高效利用提供新的途徑,同時為AgNPs在臨床、水產等抑菌領域的應用奠定基礎。