豬肉制品中單增李斯特菌污染現狀及致病力控制分析

張文敏,董慶利,辛寶,錢文文,任曉梅

1(陜西中醫藥大學 公共衛生學院,陜西 咸陽,712046)2(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)

豬肉富含蛋白質、礦物質和維生素,是人們攝取營養物質的主要來源之一。單增李斯特菌是一種胞內寄生性人畜共患致病菌,在自然界中廣泛存在,對苛刻環境耐受力極強,對豬肉的食用安全造成嚴重威脅[1]。由單增李斯特菌導致的食品安全問題不僅給消費者帶來極大的食用風險,也給食品加工業造成了巨大的經濟損失。

單增李斯特菌在豬肉中可以達到的最大污染濃度由該菌的生長特性決定。遲滯時間、最大比生長速率和最大污染濃度等生長動力學參數是描述單增李斯特菌生長特性的重要指標。通過對單增李斯特菌的生長動態進行數學建?？梢垣@得該菌的生長動力學參數。生長特性僅僅決定了豬肉被加工處理前單增李斯特菌的污染濃度,對不利環境的抗性會影響單增李斯特菌進入宿主感染周期的劑量,進入宿主感染周期后,單增李斯特菌細胞的毒性大小與宿主患病的概率密切相關。

綜上,在評估豬肉安全控制措施的有效性時,需要充分研究該措施對單增李斯特菌生長特性、抗性和毒性的影響。應用“柵欄技術”,即將2種或多種柵欄因子科學合理的組合起來,可以從不同方面控制單增李斯特菌的致病能力,從而提高豬肉的微生物安全。

1 豬肉制品中單增李斯特菌污染分析

我國是肉及肉制品生產大國?！吨袊y計年鑒》的數據顯示[2],2016—2020年,我國居民平均每年總人均肉類消費量為26.8 kg,其中豬肉為20.2 kg,遠遠高于其他畜肉。近些年,為滿足消費者對食品種類多樣化的要求,豬肉制品的種類不斷增加。同時,豬肉制品的安全問題,尤其是微生物安全問題,引起人們的廣泛關注[3]。豬肉制品營養豐富,適合多種微生物生長,因此極易感染有害微生物,單增李斯特菌是污染豬肉制品的主要致病菌之一[3]。

豬肉制品中單增李斯特菌的污染有內源性和外源性污染2種途徑。豬肉制品中單增李斯特菌的污染源頭可以追溯到飼養在農場的豬。MORALES-PARTERA等[4]從西班牙2個屠宰場的150頭豬中取了750份樣品,其中67份檢測單增李斯特菌呈陽性,陽性率高達8.9%。邱燕等[5]發現中國一些屠宰場廠中單增李斯特菌的污染率超過了25%。WANG等[6]從中國屠宰場中收集了1 322份豬糞便和104份環境樣本,共分離到了5株單增李斯特菌,包含1/2a、1/2b和1/2c三個血清型。豬體攜帶的單增李斯特菌在豬肉中生長繁殖,可能會在加工環節污染加工設備和生產環境,進而污染其它未攜帶單增李斯特菌的豬肉。

在流通和銷售階段,豬肉中單增李斯特菌的陽性率也非常高。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)在零售環節抽取了3 264份肉樣進行致病菌檢測,其中單增李斯特菌陽性檢出率為5.7%[7]。KANUGANTI等[8]從美國超市抽取了340份零售豬肉樣品,檢出單增李斯特菌陽性率為50.2%,這些菌株中有53.5%的菌株屬于家族I,可致人類和動物患病。我國很多學者也調查了流通和銷售環節的豬肉制品中單增李斯特菌污染狀況。雖然調查結果受地域和樣品量的限制,但多數結果表明豬肉制品在流通和銷售過程中單增李斯特菌污染情況較為嚴重。YU等[9]從河南零售市場上收集645份豬肉樣品,其中43份檢出單增李斯特菌,陽性率達到6.7%。WU等[10]從中國24個城市134個農貿市場收集196份肉及肉制品樣品,最終檢出單增李斯特菌陽性率為20.9%。

食品中病原微生物監測數據表明,我國各省市豬肉制品受到單增李斯特菌不同程度的污染,且部分省市污染情況相當嚴重,豬肉制品在流通過程中的單增李斯特菌污染率可高達30%(表1)。

表1 我國部分地區豬肉及豬肉制品中單增李斯特菌的陽性檢出率Table 1 Prevalence of L.monocytogenes in pork and pork products in China

2 單增李斯特菌病概述

根據遺傳指紋圖譜和致病潛力,可將單增李斯特菌分為4個不同的家族(表2)[24]。導致李斯特菌病暴發流行的主要是家族Ⅰ,家族Ⅱ主要引發零星疾病,家族Ⅲ和Ⅳ主要對動物致病,對人幾乎無致病性?；诰w/鞭毛抗原(O/H)血清學反應,將4個家族中的單增李斯特菌分為13個血清型[25]。家族I的4b血清型是致多起侵襲性李斯特菌病的血清型,且感染4b型的患者死亡率高于其他血清型感染者[25]。

表2 單增李斯特菌譜系分類總結Table 2 Summary of L.monocytogenes lineages

單增李斯特菌為兼性胞內寄生菌,可穿越宿主的腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障,在宿主細胞中存活并繁殖。動物和人類在攝入一定劑量的單增李斯特菌后會患李斯特菌病。李斯特菌病主要有非侵襲性(發熱性胃腸炎)和侵襲性疾病2種癥狀。健康的成年人患李斯特菌病后會出現發熱性胃腸炎癥狀,但是在一周內可隨著身體的新陳代謝自行緩解。對于免疫力低下人群,特別是老年人、孕婦和癌癥患者,被單增李斯特菌感染后通常會患侵襲性系統疾病,包括心內膜炎、流產和敗血癥等。另外,調查結果顯示,從被感染的孕婦體內分離出來的單增李斯特菌多為4 b血清型[25]。盡管單增李斯特菌的發病率較低,但是人們患李斯特菌病后的致死率高達20%～30%,造成了極大的死亡疾病負擔[28]。

在國外,EFSA和歐洲疾病預防控制中心(European Centre for Disease Prevention and Control, ECDC)調查數據顯示[28],從2008—2017年,歐盟國家居民患侵襲性李斯特菌病有增多趨勢,且很大比例是零星事件;2017年,歐盟國家居民中患李斯特菌病總人數為2 480人,發病率為0.48/100萬;因患李斯特菌病死亡人數為227人,死亡率為9.15%。另外,美國疾病預防控制中心的調查數據顯示,美國每年約有1 600人因食用被單增李斯特菌感染的食物而患李斯特菌病,患者主要是孕婦、新生兒、65歲以上的老年人及免疫力低下者(https://www.cdc.gov/dotw/listeria/index.html)。其他國家也有人類因食用被污染的食物而患李斯特菌病的報道,如2018年5月份,南非暴發全球歷史上最大的李斯特菌病疫情,導致1 024人患病,200例左右患者死亡,其中42%的患者為孕婦和新生嬰兒。

在中國,孫照琨等[29]收集了256例侵襲性李斯特菌病病例(1964—2013年),發現李斯特菌病多為零星事件,只有一起暴發報道(4例);進一步統計分析這些病例的臨床信息發現,256例侵襲性李斯特菌病病例中,有134例是孕婦及新生兒,占患病人數的一半左右。其余122例中,20～59歲人群的比例為63.5%;60歲以上老人的比例為15.2%。256例患者中,總體死亡率達到30.8%,新生兒組死亡率最高,為52.6%。近年來,也時有單增李斯特菌引發新生兒患李斯特菌病的病例報道:如2016年,江蘇省某醫院收診新生兒感染單增李斯特菌病1例[30]。2017年,甘肅省某醫院收診2例新生兒單核細胞增生李斯特菌的患者(https://www.sohu.com/a/200484268_653072)。

鑒于李斯特菌病在免疫力低下人群中的高致死率,十分有必要深入分析影響單增李斯特菌致人類患病能力的因素,進而有的放矢,采取有效措施降低食品中單增李斯特菌引起人類患李斯特菌病的風險。

3 影響單增李斯特菌致病能力的因素分析

由食源性致病微生物引發的食品安全問題日益受到全球關注。政府與企業間、企業與企業間進行風險管理和風險交流是降低食品安全問題的重要途徑。風險評估可為風險管理和交流提供準確的信息及技術支撐,是風險體系的基礎與核心。國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)將微生物風險評估分為危害識別、暴露評估危害特征描述和風險特征描述4部分[19]。其中,危害特征描述是風險評估的重要部分。

危害特征描述是通過劑量-效應模型(dose response model,DRM)定量(定性)描述一定劑量的單增李斯特菌進入人體后導致宿主患李斯特菌病的能力[31]。目前常用的DRM有對數模型、泊松模型和指數模型等。此處以簡單的指數模型對影響單增李斯特菌致病能力的因素進行分析,指數模型表達式如公式(1)所示:

P=1-exp(-γ×N)

(1)

式中:P,消費者患李斯特菌病的概率;N,單增李斯特菌的攝入劑量,CFU;γ,單位單增李斯特菌細胞的毒性大小。

由公式(1)可知,消費者患李斯特菌病的概率由攝入該菌的劑量及毒性大小共同決定。消費者攝入單增李斯特菌的劑量由食物中該菌的污染濃度與和攝入食物的份量共同決定。因此,攝入食物份量一定時,消費者攝入單增李斯特菌的劑量由該菌在食品中的污染濃度決定。

對不利環境的抗性會影響該菌進入宿主感染周期的劑量。如熱處理是最為常見的殺菌消毒及熟制食品的加工工藝[32],因此熱抗性會影響單增李斯特菌在食品入口前的污染濃度;被消費者攝入后,胃腸道消化系統中的不利環境是單增李斯特菌進入宿主體內感染周期的首要屏障[33]。經過消化系統存活下來的單增李斯特菌進入宿主感染周期,此時單增李斯特菌毒性大小與宿主患病的概率密切相關[34]。因此,單增李斯特菌導致宿主患病的能力由該菌的生長特性、抗性和毒性共同決定(圖1)。

圖1 影響單增李斯特菌致病能力的因素圖示Fig.1 Schematic representation for pathogenic capacity of L.monocytogenes

3.1 食品中單增李斯特菌的污染濃度

人類患李斯特菌病的概率和食品中單增李斯特菌的污染濃度緊密相關。細菌在食品中可以生長繁殖,因此即使食品中細菌的初始污染濃度較低,在經過一段時間的儲存之后,仍可以生長到較高濃度,進而威脅人們的健康安全。

單增李斯特菌在食品中能夠達到的最大污染濃度(Nmax)由該菌的生長特性決定。單增李斯特菌的生長呈“S”型,分為遲滯期、指數生長期和穩定期3個階段(圖2)。在遲滯期,單增李斯特菌積累著生長繁殖所需要的物質與能量,此時該菌的濃度為初始濃度N0。λ的大小決定了單增李斯特菌進入快速生長階段所需時間的長短。當積累了足夠的物質和能量后,細菌開始以二分裂的方式進行繁殖,μmax的大小描述了單增李斯特菌在快速生長階段的最大比生長速率。食品對細菌有一個最大容納程度(Nmax),λ和μmax共同決定了單增李斯特菌生長到穩定期的Nmax,進而影響了豬肉的微生物安全,可通過延長λ,降低μmax和Nmax從而降低單增李斯特菌的污染濃度。

圖2 細菌的生長曲線圖示[35]Fig.2 Schematic representation of bacteria growth curve[35]

3.2 食品中單增李斯特菌的抗性

對不利環境的抗性會影響該菌進入宿主感染周期的劑量?？刂剖称吩?、加工和流通環節的單增李斯特菌污染是預防李斯特菌病的主要措施。熱殺菌技術是最為常見的殺菌技術之一,熱處理可破壞細胞結構,影響胞內蛋白質表達[36],從而導致細菌失活。不同熱處理溫度致細菌失活的效果顯著不同,一般以殺死90%的細菌所需時間定為該溫度下細菌的D值。如60 ℃時,殺死豬肉中90%的單增李斯特菌所需時間約為4.72 min,單增李斯特菌的D60為4.72 min,而單增李斯特菌的D62.5是1.93 min[37]。

隨著被污染的食品進入宿主后,單增李斯特菌遇到的第一個屏障是宿主的胃腸道消化系統,包括口腔中的唾液、胃中的胃液(強酸)和腸道中的腸液(高滲透壓)。經過消化系統后存活的單增李斯特菌進入宿主體內感染周期。由圖3可知,不利環境條件導致單增李斯特菌失活時,該菌的濃度會迅速下降。

單增李斯特菌對不利環境條件的抗性與菌體本身特性及抗性基因的表達有關。在溫和的壓力環境下,單增李斯特菌的抗性依賴于細胞內大分子物質(如核酸、蛋白質和酶)的緩沖作用和菌體細胞膜(壁)特有的穩態[38]。在惡劣的壓力條件下,單增李斯特菌會啟動自身的抗性應答機制以抵抗外界壓力[39]。單增李斯特菌應對不同的環境壓力時,會啟動不同的抗性應答機制。

在高溫處理時,單增李斯特菌會開啟熱抗性應答系統。熱抗性防御系統比較保守,如在溫和熱處理時,單增李斯特菌的熱抗性因子groEL不表達,只有熱處理達到一定強度時,groEL才會大量表達以積累熱抗性蛋白來抵抗熱處理[40]。一些熱抗性蛋白自身就是毒力蛋白,還有一些熱抗性蛋白通過調控其它毒力因子的表達影響單增李斯特菌的毒性。

酸性和高滲透壓環境也是細菌常遇到的不利環境,如對食品和加工環境殺菌消毒的酸性清洗劑、酸性的食品環境和人體消化道中的胃液。在溫和酸處理條件下,細胞膜的通透性和流動性會協助單增李斯特菌適應酸性環境。在強酸性環境下,單增李斯特菌有多套調節細胞內外酸堿平衡的防御機制,如F0F1-ATPase和谷氨酸脫羧酶系統[41]。酸抗性應答機制的存在是單增李斯特菌耐受 “強酸”環境的主要原因。在宿主小腸中,單增李斯特菌會遇到腸液、胰液和膽汁等高滲透壓環境,此時甘氨酸甜菜堿轉運蛋白和膽鹽水解酶等抗性因子的存在可以協助單增李斯特菌在宿主小腸中生存[42]。

單增李斯特菌對惡劣環境條件的抗性依賴于熱抗性、酸抗性和滲透壓抗性等抗性基因的表達,而這些抗性因子均受到Sigma B (sigB)因子的調控。sigB因子位于RNA聚合酶全酶中,可以識別基因啟動子,并且與特定基因啟動子的結合位點結合以開啟抗性基因的轉錄進程,進而積累抗性蛋白以在惡劣環境下生存[43]。

食品在被消費之前所處的環境會影響單增李斯特菌的抗性。食品基質和食品貯存溫度對單增李斯特菌的生存能力影響較大。另外,在食品中添加防腐劑也能改變單增李斯特菌的抗性,如IGLESIAS等[44]研究表明生物保護菌株鼠李糖乳桿菌能夠降低單增李斯特菌在胃腸道系統中的生存能力。PETTERSEN等[45]指出先前暴露于高濃度的NaCl環境會增強單增李斯特菌在宿主胃腸道系統中的生存能力。細菌菌株特性和生長階段(遲滯期/指數期/穩定期)也影響著細菌在胃腸道系統中的生存能力[46]。

3.3 食品中單增李斯特菌的毒性

進入宿主感染周期后,單增李斯特菌細胞的毒性大小與宿主患病的概率密切相關。單增李斯特菌在孕婦體內的感染進程見圖4。

單增李斯特菌為兼性胞內寄生菌,經過宿主消化系統后,對小腸上皮細胞的的黏附與侵襲能力是單增李斯特菌穿過腸道屏障而感染宿主的前提[47]。單增李斯特菌穿過宿主的腸道屏障后可以在巨噬細胞和非巨噬細胞中生長存活并且繁殖,還可以穿過宿主的血腦屏障,進入血液循環和淋巴結循環[48],隨著血液和淋巴結擴散到宿主的肝臟和脾臟等組織器官,在器官內生長繁殖,最終導致器官病變。對于孕婦來說,單增李斯特菌還可以穿過孕婦的胎盤屏障感染胎兒[49],導致孕婦流產及新生嬰兒患腦膜炎。2018年南非暴發大規模李斯特菌病疫情中,42%的病例為孕婦和新生嬰兒。

以上分析表明,單增李斯特菌導致宿主患病的能力由該菌的生長特性、對不利環境條件的抗性和在宿主體內的毒性共同決定。先前篩選食品控制措施時主要集中于探討控制措施對致病菌數量減少的能力,忽略了抗性和毒性的影響,這會對消費者的健康安全造成潛在的威脅。如ANDERSEN等[50]指出雖然無氧氣調包裝可以降低單增李斯特菌的污染濃度,但是單增李斯特菌在無氧條件下對Caco-2細胞的侵襲能力是有氧狀態下的100倍。OMORI等[32]分析了乳酸處理后單增李斯特菌的生長特性和熱抗性,結果表明使用質量分數<3%的乳酸處理后,單增李斯特菌的數量減少,但是熱抗性增加了3.4倍。因此,充分探究食品安全控制措施對單增李斯特菌生長、抗性和毒性的影響十分必要。

4 豬肉制品中單增李斯特菌的控制

4.1 物理技術

物理滅菌方法是食品工業中較為常見的抑(殺)菌技術。物理方法滅菌速度快、效率高,已經被廣泛應用于食品質量和安全控制中。熱殺菌、非熱殺菌、冷凍冷藏和氣調保藏等都是常見的物理柵欄因子。熱殺菌技術包括遠紅外加熱殺菌、微波殺菌、超高溫瞬時殺菌、高壓殺菌和常壓殺菌(巴氏消毒法)等。非加熱殺菌不需要對食品加熱而殺死微生物,如輻照、高壓和超聲波。冷凍殺菌通過降低溫度破壞致病菌的細胞結構和蛋白質表達,但是同時食品細胞也會受損,從而導致食品質量下降。氣調包裝可將食品和外界的環境隔離開,預防環境中的微生物污染食品,還可通過改變氣體環境抑制食品中微生物的生長[51]。近年來,物理柵欄因子不斷擴增和改進,在食品質量與安全控制中得到了廣泛應用。

4.2 化學技術

化學抑菌技術包括鹽保藏法、糖保藏法、醋保藏法、酒保藏法及防腐劑保藏法等。鹽保藏法和糖保藏法的主要原理是通過增加食品環境中的鹽濃度和糖濃度,使得食品環境中(細菌外部)的滲透壓增加,細菌細胞內外滲透壓不平衡,細胞內部的水分外流,造成細菌細胞質壁分離,最終導致細胞死亡。醋和酒的濃度比較高時,也能通過打破細胞內外的滲透壓平衡導致細菌失活。

根據防腐劑的來源和性質,可將防腐劑分為無機防腐劑和有機防腐劑。無機防腐劑主要包括硝酸鹽和亞硝酸鹽、食鹽和CO2氣體等。有機防腐劑主要包括山梨酸及其鹽、苯甲酸及其鹽和一些天然防腐劑。防腐劑的主要抑菌原理是通過改變細菌酶類的合成、降低蛋白質的活性和破壞細胞膜結構,進而抑制細菌生長[52]。隨著消費者對食品安全需求的提高,越來越多的天然防腐劑如魚精蛋白、茶多酚、乳酸鏈球菌素(nisin)和其他動植物及微生物提取物被應用在食品工業中。

4.3 生物技術

生物抑菌因子一般是從動物、植物和微生物體內(或者微生物自身)直接提取出來的天然物質,在自然界中天然存在,對消費者健康無負面影響,因此受到消費者的歡迎[53]。微生物和它們的天然產物在食品防腐抑菌中起著關鍵作用。生物保護菌(bioprotective cultures)是將活性微生物菌體直接添加到食品中,在不影響食品感官品質的前提下,可延長食品保質期和/或抑制致病菌生長[54]。

將生物保護菌應用于食品安全控制有以下幾個條件:第一,添加到食品中的生物保護菌必須是相關標準允許的;第二,添加到食品中的生物保護菌不能對人體健康產生有害影響;第三,應用在食品中的生物保護菌在食品中需保持較高活性,能夠在食品中生存和繁殖[55];第四,生物保護菌不能對食品的感官品質產生較大的負面影響[56]。

近年來,將生物保護菌應用于食品中提高食品微生物安全的研究較多。如CASTELLANO[53]等綜述了將產細菌素的乳酸菌作為生物保護菌應用在鮮豬肉中抑制單增李斯特菌的相關研究。HOSSAIN等[55]總結了益生菌作為生物保護菌在提高農產品感官品質和微生物安全上的應用,并且指出選取特定的益生菌在農產品表面涂膜可以延長農產品的貨架期、提高農產品的微生物安全。CALO-MATA等[56]總結了乳酸菌及其產生的細菌素在水產品微生物安全控制中的應用。WORAPRAYOTE等[57]將乳酸菌及其產生的細菌素添加到禽肉丁中抑制致病菌的生長,取得了良好效果。

4.4 柵欄技術

食品抑菌的基本原理是采用物理法、化學法和生物法預防食品被微生物污染,并且殺死(抑制)食品中已經存在的微生物。在食品加工和保藏過程中,僅靠一種防控措施很難達到理想的抑菌效果。一般是將多個不同的防控措施科學的組合起來,從不同的方面對有害菌形成綜合控制,這種方法叫做柵欄技術,這些單個的防控措施叫做柵欄因子。

利用柵欄技術控制單增李斯特菌的致病性能夠取得更好的效果。目前將氣調包裝結合其他抑菌措施抑制單增李斯特菌的文獻較多。IRKIN等[58]發現單獨使用高濃度CO2氣調包裝能夠抑制單增李斯特菌的生長,但是聯合精油對單增李斯特菌的抑制效果更好。CHOULIARA等[59]也指出CO2氣調包裝結合生物抑菌劑牛至精油對新鮮雞胸肉中單增李斯特菌的控制效果比二者單獨使用增強很多。HUGAS等[60]將產細菌素的清酒乳桿菌添加到CO2氣調包裝豬肉中抑制單增李斯特菌的生長,取得了良好的抑制效果。LPEZ-MENDOZA等[61]在CO2氣調包裝牛排中添加了抑菌劑乳酸和nisin,發現3種柵欄因子聯合應用能夠將單增李斯特菌的濃度降低4.0 lg CFU/g左右,并且這種聯合處理對牛排的色澤、質構和pH值沒有負面影響。

5 結論及展望

單增李斯特菌在豬肉中的Nmax由該菌的生長特性決定。運用食品預測微生物學方法研究致病菌的生長特性是提高食品安全監控水平的有效措施之一。單增李斯特菌導致宿主患病的能力和該菌的生長特性、抗性和毒性密切相關,因此采用控制措施時應考慮其對上述因素的影響。

盡管各種抑菌技術應用于食品中單增李斯特菌控制已有很長歷史,但要使得抑菌技術發揮最大的潛力并服務于食品安全控制還有很多工作需要完善,現將未來的研究方向展望如下:

(1)大量研究證明,不同的抑菌技術可從不同方面控制單增李斯特菌的致病力,采用“柵欄效應”的方法,可以更好的保障食品安全。

(2)先前的研究集中于監測抑菌技術對單增李斯特菌菌落濃度的影響,很少具體分析單增李斯特菌動力學參數的變化。而細菌的生長特性是由λ、μmax及Nmax三個參數共同影響的。因此,充分探討抑菌技術對單增李斯特菌λ、μmax及Nmax的影響十分必要。

(3)現有的研究很多是將肉制品的背景菌消除后,研究抑菌技術對肉制品中單增李斯特菌的抑制作用。實際肉制品中多種微生物共存,它們之間相互影響。因此研究實際食品狀態下抑菌技術對單增李斯特菌的抑制作用具有十分重要的現實意義

(4)探究抑菌技術對豬肉中單增李斯特菌生長特性、抗性和毒性的影響及其作用機制,可為抑菌技術應用到豬肉中降低單增李斯特菌危害,提高豬肉微生物安全提供理論支持和科學依據。