補陽還五湯通過調控PI3K/Akt、JAK2/STAT3信號促進BMSC趨化遷移對外傷性脊髓損傷大鼠神經元活性及認知功能的影響

宋穎軍 李旭 劉小舟 張國福

(江西中醫藥大學附屬醫院,江西 南昌 330006)

外傷脊髓損傷是中樞神經系統的嚴重損傷,多發生于交通事故、墜落等,是發病率及致殘率較高的一種疾病。脊髓損傷后,脊髓內部岀血、水腫,出現神經元凋亡、壞死等現象,進而導致神經系統功能破壞〔1,2〕。目前認為,神經細胞凋亡是脊髓損傷后神經功能障礙的主要原因,磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)具有調控細胞增殖及凋亡的作用。研究表明〔3〕PI3K、磷酸化(p-)Akt在脊髓損傷發展過程中表達升高,與脊髓損傷機體脊髓細胞凋亡有關?；蛘{控的啟動需要復雜而周密的信號轉導系統,內源性酪氨酸激酶(JAK)/信號傳導和轉錄啟動因子(STAT)通路是近年來備受關注的一條通路,具有調節細胞生物學行為及免疫功能的作用。研究表明〔4〕,脊髓損傷后可異常激活該通路,從而導致神經細胞凋亡。補陽還五湯是中國清代著名醫家王清任所創立的經典方劑,該方由黃芪、赤芍、當歸、地龍、川芎、桃仁和紅花藥物組成。已有報道證實〔5〕該方劑在促進損傷神經再生修復等方面有其獨特的效果。本文探討補陽還五湯通過調控PI3K/Akt、JAK2/STAT3信號促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)趨化遷移對外傷性脊髓損傷大鼠的神經元活性及認知功能的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物與分組 選取健康大鼠53只,購自北京億鳴復興公司提供〔生產許可證號:SCXK(京)-2019-0034〕。大鼠體質量220～300 g,常規飼養,自由飲食飲水。隨機分為健康組(健康大鼠常規飼養)、損傷組(建立脊髓損傷模型)、干預組(脊髓損傷模型+補陽還五湯)、對照組(脊髓損傷模型+甲潑尼龍),每組12只,剩余5只大鼠用于補陽還五湯含藥血清制備。本研究經醫院動物倫理委員會批準。

1.2實驗試劑 結晶紫溶液(南京生航公司);PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt一抗(廣州柏賽柯公司);辣根過氧化物酶二抗(西安齊岳公司);伊紅染色液(北京金克隆公司);TUNEL反應液(蘇州優逸蘭迪公司);蘇木素染色液(大連芮禹公司);RIPA裂解液(武漢卡諾斯公司)。

1.3藥物制備 補陽還五湯由醫院制劑室加工,1 ml湯藥含生藥4 g,即4 g/ml質量濃度,無菌封瓶,-20 ℃冰箱保存備用。甲潑尼龍購自廣州貝爾卡公司。

1.4模型建立及給藥 健康組大鼠無處理,其余各組大鼠戊巴比妥鈉麻醉,俯臥位固定在T8棘突中心作長約3 cm切口暴露硬脊膜,采用Allen裝置以20 g×25 mm損傷力度行重物打擊法制作大鼠外傷性脊髓損傷模型。模型制備成功判定標準:脊髓打擊后,損傷處脊髓出血、水腫,大鼠出現擺尾反射,雙下肢及軀體回縮樣撲動,麻醉清醒后雙下肢成弛緩性癱瘓〔6〕。建模成功后損傷組無處理,干預組給予制備好的補陽還五湯1 ml灌胃,1次/d,28 d〔7〕,對照組經腹腔注射給予甲潑尼龍30 mg/kg,1次/d,28 d。

1.5BMSCs分離養鑒定 根據文獻〔8〕大鼠原代BMSCs提取方法,戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,于75%酒精中浸泡消毒5～10 min。使用眼科剪將10只轉T克隆綠色熒光蛋白(GFP)基因的大鼠雙側股骨及脛骨取出,浸泡于預冷的培養基,使用10 ml注射器沖洗骨髓腔直至股骨脛骨變白,1 000 r/min離心5 min。使用含有10%胎牛血清和1%雙抗體(青霉素-鏈霉素)完全培養基重懸浮,置于T12的培養瓶中培養24 h后更換培養基。之后每隔2 d更換培養基。當細胞融合率達到70%～80%時進行細胞傳代。光鏡下檢測細胞形態。

1.6脊髓組織提取 取各組大鼠,麻醉后處死,從背部原切口進入,切取2 cm損傷部位及其上下段脊髓組織,置于EP管中,-70 ℃備用。

1.7補陽還五湯含藥血清的制備 取5只大鼠給予補陽還五湯3 ml灌胃,2次/d,共1 w,末次灌胃1 h后腹主動脈取血,離心后取上清,置于-20 ℃保存〔9〕。

1.8檢測指標

1.8.1流式細胞術鑒定BMSCs細胞 取第三代細胞通過流式細胞術鑒定細胞表面標記CD29、CD90、CD45和CD31以檢測細胞純度。純度評估后,使用第三代的細胞以1×105/ml密度在成骨和成脂專用培養基中進行BMSCs定向成骨細胞、成脂、成神經細胞分化誘導培養。

1.8.2Transwell小室法檢測補陽還五湯對大鼠BMSCs遷移的影響 取BMSCs放入完全培養基內培養,于12 h觀察BMSCs遷移情況。取第三代BMSCs,分為空白組(常規培養),含藥血清組(加入2.6 g/ml補陽還五湯含藥血清〔9〕),藥物對照組(加入10-7mol/L甲潑尼龍〔10〕),培養24 h后,調整細胞密度為5×104/孔,100 μl接種于Transwell上室;下室加入完全培養基600 μl,37 ℃培養12 h后取出Transwell,吸掉上下室培養液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍,4%多聚甲醛固定30 min。晾干,擦去上層未遷移細胞。結晶紫染色20 min。使用光學顯微鏡進行觀察,隨機選擇5個視野進行細胞計數。重復3次,每次3個復孔。

1.8.3高架十字迷宮和Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能 脊髓損傷后8 w進行。常溫,調節燈光,測試5 min,每只測試1次,安撫大鼠使之適應環境。記錄開放臂進入次數及迷宮內進行的總路程。用Smart2.0軟件分析數據。

于損傷后第7周對大鼠進行水迷宮實驗訓練,于第8周測試。測試分為定位航行:4 d,從迷宮4個象限入水,每天第1次訓練均從目標象限對側放入迷宮內;空間探索:3 d,取消平臺,在1.5 min內記錄大鼠穿越平臺次數。Smart2.0軟件分析數據。

1.8.4蘇木素-伊紅(HE)染色檢測脊髓組織病理形態 取各組脊髓組織,脫蠟、水洗后,蘇木素染色15 min。經酸水及氨水中分色數秒。流水沖洗后入經70%、90%乙醇脫水。再置于伊紅染色液染色2～3 min。染色后的切片經無水乙醇脫水,二甲苯透明后滴加樹膠,封片固定,于光學顯微鏡下觀察。

1.8.5TUNEL檢測脊髓組織神經細胞凋亡 脊髓組織石蠟切片經二甲苯、梯度乙醇洗脫后,PBS沖洗,置于含2%蛋白激酶K消化15 min,PBS沖洗2次。滴加TUNEL反應液,避光孵育1 h,PBS沖洗2次,加入DAPI、22%甘油緩沖液封片。熒光顯微鏡下觀察并計算神經細胞凋亡數。

1.8.6免疫組化檢測p-JAK2、p-STAT3水平 取各組大鼠脊髓組織標本,常規切片,按SP試劑盒說明書進行操作:烤片、脫蠟至水、高壓修復、3%過氧化氫(H2O2)去離子水處理、封閉、滴加一抗過夜(p-JAK2 1∶50、 p-STAT3 1∶100),次日滴加二抗、金黃色葡萄球菌蛋白A-辣根過氧化物酶(HRP)標記抗原工作液,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蒸餾水終止顯色,PBS沖洗,蘇木素復染、沖洗、梯度酒精脫水,透明,中性樹膠封片。光鏡觀察,以細胞質棕黃色著色為陽性細胞,取 3個視野,分別計數每個視野的陽性細胞數,取平均值。

1.8.7Western印跡檢測脊髓組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt水平 取脊髓組織,RIPA裂解液裂解,離心。收集上清液,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量。取適量蛋白質,加入上樣緩沖液,95 ℃煮沸5 min,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后,將分離的蛋白條帶轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h之后加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt一抗,4 ℃孵育過夜。TBST清洗,加入HRP二抗,37 ℃孵育2 h-TBST洗膜,加入電化學發光(ECL)液避光顯影。ImageJ圖像軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.9統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1BMSCs鑒定結果 傳代后的培養細胞呈旋渦狀或放射狀貼壁生長,細胞多呈星形、梭形或三角狀,培養3代后,細胞貼壁加快、形態均一,呈旋渦狀或單層放射狀生長。見圖1。

圖1 各組BMSCs細胞形態(×200)

2.2BMSCs遷移結果 空白組BMSCs細胞遷移數量〔(243.32±25.68)個〕顯著低于含藥血清組〔(309.45±34.81)個〕與藥物對照組〔(304.72±38.27)個〕(P<0.05)。含藥血清組與藥物對照組細胞遷移數量無統計學差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組BMSCs遷移(結晶紫染色,×400)

2.3各組認知功能檢測 與健康組相比,損傷組總路程、進入開臂次數、穿越平臺次數顯著降低,不同時間的潛伏期顯著升高(P<0.05)。與損傷組相比,干預組和對照組總路程、進入開臂次數、穿越平臺次數顯著升高,不同時間的潛伏期顯著降低(P<0.05)。干預組與對照組各指標對比無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組認知功能對比

2.4HE染色結果 健康組脊髓組織結構完整。損傷組脊髓組織疏松水腫,有細胞空泡變性產生。相較于損傷組,干預組與對照組脊髓組織病理形態有所改善。見圖3。

圖3 各組脊髓組織病理學形態(HE染色,×200)

2.5神經細胞凋亡率檢測結果 健康組脊髓組織神經細胞凋亡率〔(1.28±0.64)%〕顯著低于損傷組〔(31.42±4.97)%〕(P<0.05)。損傷組凋亡率顯著高于干預組〔(11.04±2.13)%〕和對照組〔(12.46±2.07)%〕(P<0.05)。干預組凋亡率與對照組無統計學差異(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組脊髓組織神經細胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.6p-JAK2、p-STAT3水平檢測結果 健康組脊髓組織中p-JAK2、p-STAT3陽性細胞數顯著低于損傷組(P<0.05)。損傷組p-JAK2、p-STAT3顯著高于干預組和對照組(P<0.05)。干預組與對照組各指標對比無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖5。

表2 各組脊髓組織p-JAK2、p-STAT3陽性細胞數及PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt水平對比

圖5 各組p-JAK2、p-STAT3陽性細胞數(免疫組化染色,×400)

2.7PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt水平檢測結果 健康組脊髓組織中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt水平顯著高于損傷組(P<0.05)。損傷組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt水平顯著低于干預組和對照組(P<0.05)。干預組與對照組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt水平無統計學差異(P>0.05)。見表2、圖6。

圖6 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt水平

3 討 論

BMSCs是一種具有良好分化能力且較容易分離獲取的成體干細胞,作為種子細胞在治療顱腦損傷和脊髓損傷方面取得了較好療效。其治療脊髓損傷的機制主要有作為種子細胞遷移到受損部位分化替代受損的細胞,合成分泌生長因子,如血管內皮生長因子(VEGF)、神經膠質源性神經生長因子等促進組織修復,BMSCs還有良好的抗炎及免疫調節等功能并能夠抑制小膠質細胞過度活化的能力。中醫認為脊髓損傷屬于督脈受損,經脈瘀阻,加之患者多因外傷而大傷元氣,導致血瘀氣虛之癥,近年來已有研究證實〔11〕補陽還五湯對脊髓損傷患者具有一定的治療作用,且補陽還五湯中當歸尾具有活血祛瘀、補血通經、止痛活絡等功效;赤芍具有清熱涼血、化瘀等功效;桃仁具有活血化瘀、抗炎鎮痛等作用。甲潑尼龍主要可以起到消炎的作用,是一種短效激素,起效快,副作用小,治療脊髓損傷效果較好。秦豐偉等〔12〕運用大鼠建立脊髓損傷模型并進行的實驗中,發現淫羊藿苷聯合BMSCs通過降低脊髓損傷區域的炎癥水平,改善大鼠脊髓損傷病情的嚴重程度。范瑜潔等〔13〕在對脊髓損傷大鼠的實驗中提出,補陽還五湯可促進BMSCs增殖并向神經肝細胞方向分化。本文研究與上述研究結果相似。

以往對于脊髓損傷的實驗中,主要灌注的為運動、感覺功能障礙等,對于認知功能等易被忽視。已有研究證實〔14〕,脊髓損傷后患者會出現記憶障礙、焦慮等。本文進一步完善了脊髓損傷大鼠認知功能的行為血評價,并增加了焦慮測試,證實了大鼠在8 w后會出現學習和空間記憶能力衰減,通過高架十字迷宮實驗發現,大鼠還具有抑郁、探索興趣減退等情緒障礙。房濤等〔15〕通過將腦梗死患者分為對照組與觀察組并運用補陽還五湯進行治療發現,補陽還五湯可通過提高患者的血清胰島素樣生長因子(IGF)-1水平,改善神經功能缺損及認知功能。本研究結果與上述研究相似。

脊髓損傷是臨床上常見的中樞神經系統疾病,致殘率較高。脊髓損傷的主要病理變化是神經細胞凋亡,神經細胞凋亡以核染色質固縮、DNA斷裂、電泳呈梯帶分布為特征,是脊髓損傷后神經細胞死亡的主要方式。研究發現,在中樞神經系統缺血性和機械性損傷模型中,廣泛存在DNA損傷,可表現為神經細胞凋亡 、DNA的片段化和轉錄水平修復相關基因表達等〔16〕。TUNEL可以檢測細胞基因組DNA斷裂等,從而反映細胞凋亡情況。本研究提示,補陽還五湯能夠在一定程度上減弱損傷后脊髓神經元凋亡的現象,從而進行神經保護 。黃芪與當歸是補陽還五湯中的兩味藥材。李虎虎等〔17〕在實驗中提出,黃芪具有抑制糖尿病大鼠神經細胞凋亡的作用。朱麗娟等〔18〕在實驗中提出,當歸通過激活細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路可抑制缺血再灌注神經細胞的凋亡。本研究顯示,在經過補陽還五湯藥物干預后,神經細胞凋亡減少,提示其具有保護神經的作用。

有研究顯示〔19〕,神經元損傷后,可進行自我修復,但此過程需要多種基因參與調控,包括神經生長因子和凋亡相關基因等,而這些基因又受到信號轉導通路的調控。研究發現〔20〕,PI3K/Akt通路不僅在胰島素調節糖代謝中發揮重要作用,還能促進神經細胞的存活和抗凋亡,并調節神經細胞的分化和運動。Akt是PI3K的主要靶蛋白之一,Akt通常磷酸化后被激活,磷酸化的Akt可通過激活蛋白激酶C 和線粒體ATP敏感性鉀離子通道,改善線粒體功能,抑制線粒體釋放凋亡因子,在細胞凋亡調控過程中發揮關鍵作用。有研究提出〔21〕,丹參酮ⅡA可能通過提高脊髓損傷大鼠脊髓組織PI3K、Akt mRNA和蛋白表達水平促進脊髓神經功能的恢復。另研究表明〔22〕,PI3K/Akt通路激活通過調節抗凋亡和自噬反應在脊髓損傷中起著重要的神經保護作用。 Akt磷酸化可削弱神經細胞凋亡相關下游分子的表達,如裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、6、9,B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax),導致Bcl-2/自噬基因芐氨素(Beclin)-1復合物的解離,該過程釋放Beclin-1并導致自噬反應。在吳曉光等〔23〕對腦出血模型大鼠的實驗研究中提出,補陽還五湯通過激活PI3K并與其下游因子Akt結合,使Akt從細胞質向細胞膜轉移的同時,改變其構象,使Akt的Thr308位點及Ser473位點發生磷酸化,活化的Akt通過調控Bcl-2等凋亡相關但表達的表達,從而抑制腦出血神經細胞凋亡,保護腦組織。本研究發現,在脊髓損傷中PI3K、Akt水平降低,經過藥物干預后PI3K、Akt水平升高。陳博威等〔24〕對腦出血小鼠的實驗中提出,補陽還五湯通過窖蛋白(Cav)-1調控PI3K/Akt信號通路活性,改善病情嚴重程度。Qiu等〔25〕針對腦出血患者的實驗中提出,補陽還五湯能夠激活人CXC趨化因子受體(CXCR)4-PI3K 自噬軸信號傳導通路,既能夠激發細胞自噬,又能夠調控細胞自噬狀態,實現抑制細胞凋亡的腦保護作用。本文研究與上述研究結果相似,推測補陽還五湯可能是通過促進PI3K、Akt激活PI3K/Akt通路,發揮神經保護作用,減少神經細胞凋亡,改善病情。且本文HE染色結果與TUNEL結果也可證實上述結論。

近年來,國內外學者發現,JAK2/STAT3 信號轉導通路在免疫系統和腫瘤相關疾病中重要作用。該通路是多種細胞因子和生長因子信號轉導的共同通路,在調控細胞生物學行為中具有重要作用。脊髓損傷可激活JAK/STAT 信號轉導通路。已有研究證實〔26〕,脊髓損傷后 STAT3 信號轉導對神經細胞凋亡有重要的調節作用。相關研究報道〔27〕,腦缺血后可激活JAK2/STAT3 通路,p-STAT3入核后可調控大量基因水平,直接參與神經元凋亡。研究發現〔28〕,JAK2/STAT3 信號通路可誘導大量的大腦皮質神經元細胞凋亡。另有研究提出〔29〕,JAK2/STAT3 信號轉導通路在許多實體腫瘤和血液腫瘤中被激活,可能與其促進生長和抗凋亡作用有關。在杜全宇〔30〕研究肺纖維化的實驗中提出,補陽還五湯通過抑制JAK2/STAT3 通路水平,抑制上皮細胞和成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化,提示補陽還五湯可抑制JAK2、STAT3表達。本文研究發現,脊髓損傷后JAK2、STAT3水平升高,在經過藥物干預后JAK2、STAT3水平降低。王凱華等〔31〕在對腦出血大鼠的實驗研究中提出,補陽還五湯通過抑制JAK2/STAT3 通路,減少神經細胞凋亡,改善神經功能,從而發揮治療作用。

綜上所述,補陽還五湯通過激活PI3K/Akt通路,抑制JAK2/STAT3信號通路的激活,促進BMSCs的遷移,減輕神經細胞的凋亡,起到神經保護的作用,從而改善脊髓損傷大鼠的認知功能。