胃癌組織內miR-34a與miR-27b表達及其抑制胃癌生長與血管生成的機制

楊向超 李昌偉 周曉華 李合

(海南醫學院第一附屬醫院普通外科,海南 ?？?570102)

近年來,隨著衛生和飲食習慣的改善,胃癌的發病率已逐漸降低,但該疾病仍是全球第五大常見的癌癥類型,每年有100萬以上的新病例出現且導致78萬例患者發生死亡〔1〕。胃癌的高死亡率主要歸因于缺乏精確的早期診斷標準及無效治療〔2〕。目前,手術治療、免疫治療和靶向治療是胃癌治療的主要手段,然而,多數患者在進行手術治療生存率和預后不佳。而腫瘤細胞獲得性或原發性耐藥的產生也使得多數接受化療的患者預后很差〔3〕。

近年來,微小RNA(miRNA)已成為用于癌癥或其他疾病診斷研究的重點內容。miRNA在體液中穩定存在,能夠被外泌體所覆蓋,因此不會被內源性RNA降解酶(RNase)所破壞〔4〕。miRNA是長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA,其主要功能是抑制或促進細胞內特異性基因的表達,進而調節細胞的增殖、侵襲和遷移等過程。miR-34a位于人類染色體抑癌區域1p36.23,其表達受到P53信號通路調節;miR-27b則是位于C9orf3基因第14個內含子,以往研究表明,miR-34a和miR-27b參與了多種腫瘤發生發展的關鍵環節,包括細胞周期、分化、轉移及黏附等〔5～8〕。血管內皮生長因子(VEGF)是缺氧誘導的促血管生成因子,其受體包括VEGFR-1/2/3,屬于受體酪氨酸激酶,主要分布在內皮細胞、骨髓源細胞和神經元細胞膜中。其中,VEGFR-2幾乎介導所有的VEGF誘導血管生成作用,在血管生成過程中,磷酸化的VEGFR2啟動下游信號傳導級聯反應,涉及細胞存活、生長和遷移等多個細胞過程〔9,10〕。本研究檢測胃癌組織及癌旁組織中miR-34a、miR-27b的表達,通過體介導法過表達兩個miRNA觀察胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及血管生成的變化情況,并初步探索其在胃癌生長和轉移中的分子機制。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集 收集15例胃癌組織及距癌組織邊緣5 cm以上的癌旁組織,均為海南醫學院第一附屬醫院2018年12月至2020年6月胃癌手術切除標本,其中男11例,女4例,年齡25～72歲,平均(48.0±4.45)歲。大體分型為:潰瘍型4例,浸潤潰瘍型7例、彌漫浸潤型4例;分化程度為:低分化8例、中分化4例、高分化3例;TNM分期為:Ⅰ級2例、Ⅱ級5例、Ⅲ級7例、Ⅳ級1例?；颊咝g前均未接受化療及放療,且臨床資料完整,未有合并其他腫瘤者。所有病例標本由2位專業病理科大夫診斷,患者及家屬均簽署知情同意書,本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與材料 人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司,Trizol試劑盒購自南京諾維贊生物公司,miRNA逆轉錄試劑盒和實時熒光定量 qPCR試劑盒購自Genecopoeia公司,免疫組織化學染色試劑盒購自武漢博士德生物公司,Lipofectamine3000轉染試劑盒購自美國Promega公司,CCK-8和EdU試劑盒購自杭州四季青公司,Transwell小室購自康寧公司,VEGF與VEGFR2酶聯免疫試劑盒購自南京凱基生物公司,雙熒光素酶試劑盒、基質膠膠、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和電化學發光(ECL)液購自上海碧云天生物研究所,兔抗人VEGF,兔抗人KDR、兔抗人FLK-1購自英國Abcam公司,鼠抗人β-actin和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔購自上海昊鑫生物公司,野生型(WT-VEGF 3′-UTR)和突變型(MUT-VEGF 3′-UTR)VEGF 3′-UTR質粒載體及引物序列均由上海生工生物工程公司構建合成。

1.3方法

1.3.1胃癌組織及癌旁組織miR-34a、miR-27b的檢測 使用Trizol試劑從研磨破碎的胃癌組織及癌旁組織中抽提總RNA,紫外分光光度計檢測RNA純度與濃度,OD260/OD280值的范圍在1.8～2.0即為合理。根據 TaqMan? miRNA Reverse Transcription Kit將總RNA進行反轉錄獲取cDNA,接著利用TaqMan MiRNA Assays試劑盒進行實時熒光定量PCR實驗檢測各樣本組織中miR-23a和miR-27b的表達水平變化,以U6作為內參。反應條件為:95 ℃,10 min;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;擴增40次。實驗重復3次,擴增結束后,根據2-ΔΔCt法來計算miRNA的相對表達水平。具體引物序列:miR-34a上游引物:5′-GCCGCGGGGTTCCTGGGGAT-3′,下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;miR-27b上游引物:5′-GGGGTTCACAGTGGCTAAG-3′;下游:5′-CAG TGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCAGAATTTGCGT-3′;序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2胃癌組織及癌旁組織中VEGF表達的檢測 通過免疫組織化學染色方法檢測胃癌組織標本及癌旁組織標本VEGF表達。將組織固定好后,制備石蠟切片,脫蠟至水,0.3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育30 min,抗原高溫微波熱修復,10%山羊血清封閉非特異性位點,室溫孵育1 h,滴加兔抗VEGF(1∶200)一抗工作液,4 ℃孵育過夜。次日,滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液(1∶1 000),室溫孵育1 h,滴加二氨基聯苯胺(DAB)染色,蘇木素復染細胞核,二甲苯透明,封片,所有操作嚴格按照說明書進行。結果判斷:VEGF蛋白陽性表達定位于細胞膜或細胞質內,呈棕黃色。通過光學顯微鏡在低倍鏡(40倍)下選取細胞密集區域,隨機選取5個高倍視野(400倍)計數100個細胞,計算陽性細胞占總細胞的百分率。

1.3.3細胞分組與轉染 取對數生長期的SGC-7901細胞接種于12孔板內,每孔細胞數為1×105個,放在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養,待細胞融合度達到80%以上,進行轉染實驗。實驗具體分組:①空白對照A組、miR-34a mimic組、miR-34a NC組;②空白對照B組、miR-27b mimic組、miR-27b NC組。將Lipofectamine3000分別與50 nmol/L miR-34a mimic、50 nmol/L miR-27b mimic及50 nmol/L對應的陰性對照轉染至SGC-7901細胞中,操作嚴格按照試劑盒說明書進行,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱轉染6 h 后,更換新鮮培養基,繼續培養48 h后用于后續實驗。為保證轉染效果,轉染每2 d執行1次。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖活性 SGC-7901細胞轉染后置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱內培養,分別于培養24、48、72 h時,每孔加入10 μl CCK-8試劑液,混勻后繼續置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱繼續培養2 h,使用酶聯免疫檢測儀測定450 nm處吸光度值,實驗重復3次。

1.3.5EdU實驗檢測細胞增殖水平 SGC-7901細胞轉染后按1×105個/孔的密度接種在24孔板,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養24 h,隨后更換終濃度為10 μmol/L EdU的培養基培養,繼續培養2 h后棄培養基,PBS洗滌細胞,滴加4%多聚甲醛室溫固定20 min,棄固定液,加入甘氨酸孵育5 min,PBS洗滌后,使用0.5% Triton X-100穿透細胞膜10 min,PBS洗滌細胞,再加入Apollo567熒光染料室溫避光染色30 min,甲醇清洗細胞,接著加入Hoechst33342反應液,室溫避光孵育30 min,棄反應液,PBS清洗細胞后,甘油封片,利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況,其中藍色熒光為細胞核,紅色熒光為EdU陽性細胞。

1.3.6Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 在24孔Transwell小室上室加入50 μl稀釋的基質膠,置于37 ℃待膠凝固。將轉染的SGC-7901細胞密度調整為2×104個/ml,吸取200 μl懸液加入Transwell 小室上室,下室加入600 μl含10%胎牛血清新鮮培養液,置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24 h,培養結束后取出小室,棄培養液并擦去上室細胞,在小室中加入4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色,PBS清洗多余染液,光學顯微鏡下觀察拍攝圖像,隨機選擇5個視野計數,計算細胞侵襲數目,結果取平均值。遷移實驗除不鋪基質膠外,其他步驟均與上述侵襲實驗相同。

1.3.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞上清液VEGF、VEGFR2水平 SGC-7901細胞轉染后培養48 h,收集細胞上清,以4 000 r/min離心5 min,吸取等量的上清于離心管。按照VEGF與VEGFR2的酶聯免疫試劑盒說明書檢測細胞上清中VEGF、VEGFR2的濃度,操作嚴格按照試劑盒說明書步驟執行。

1.3.8熒光素酶報告系統檢測miR-34a、miR-27b與VEGF的靶標關系 通過生物信息學工具TargetScan7軟件,并參考VEGF 3′-UTR序列,預測miR-34a、miR-27b與VEGF 3′-UTR結合的靶位點序列,設計并合成野生型(WT-VEGF 3′-UTR)和突變型(MUT-VEGF 3′-UTR)VEGF的3′-UTR質粒載體。將對數生長期的SGC-7901細胞以1×105個/孔的密度接種于24孔板中培養,使用 Lipofactamine3000分別將miR-34a mimic、miR-27b mimic或對應的陰性對照聯合構建好的WT-VEGF 3′-UTR 質粒載體或MUT-VEGF 3′-UTR質粒載體轉染到SGC-7901細胞,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h 后,PBS沖洗細胞,加入裂解液裂解細胞,根據雙熒光素酶試劑盒操作說明書,檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.3.9Western印跡檢測細胞中KDR、FLK-1蛋白表達 收集轉染后SGC-7901細胞,PBS清洗后加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,通過BCA法測定蛋白質含量。取等量各組蛋白樣品30 μg加樣,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質,電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,TBST洗膜,接著加入兔抗KDR(1∶300)、FLK-1(1∶300)一抗工作液,以鼠抗β-actin作為內參蛋白(1∶5 000),4 ℃下孵育過夜;次日,棄一抗工作液,TBST洗膜,加入對應辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(1∶5 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL液顯色3 min,凝膠成像系統拍照,Image Pro-Plus系統分析各蛋白條帶的灰度值,計算各蛋白的相對表達水平。

1.3.10靜脈內皮細胞的成管實驗 將稀釋后的基質膠加入24孔板中,置于37 ℃孵育1 h,待膠凝固形成基質膜。取對數生長期的HUVECs,消化后,將濃度調整為5×106個/ml,取200 μl細胞懸液接種于鋪好基質膠的24孔板,分別加入轉染后培養48 h的SGC-7901細胞上清液培養,置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養48 h,終止培養,在倒置顯微鏡下觀察HUVECs成管情況。

1.4統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1胃癌組織及癌旁組織miR-34a、miR-27b表達比較 胃癌組織中miR-34a(1.00±0.05)與miR-27b的相對表達水平(1.00±0.06)均顯著低于癌旁組織中的表達水平(3.02±0.31,3.11±0.34),差異具有統計學意義(t=38.524、26.981,均P=0.000)。

2.2胃癌組織及癌旁組織VEGF表達比較 免疫組織化學染色結果可見,胃癌腫瘤組織細胞胞質內出現棕黃色染色,癌旁組織內染色較淺,細胞著色較少,胃癌組織VEGF陽性表達率顯著高于癌旁組織VEGF陽性表達率〔(38.0±4.2)% vs (11.3±0.89)%;t=34.152,P<0.01〕,見圖1。

圖1 免疫組織化學染色檢測胃癌組織及癌旁組織VEGF表達(×400)

2.3轉染后SGC-7901細胞miR-34a、miR-27b表達比較 與空白對照A組(1.00±0.09)比較,miR-34a mimic組細胞miR-34a相對表達水平(3.1±0.43)顯著升高(P<0.01),miR-34a NC組細胞miR-34a表達(1.06±0.09)變化無統計學差異(P>0.05)。與空白對照B組(1.00±0.06)比較,miR-27b mimic組細胞miR-27b相對表達水平(2.4±0.34)顯著升高(P<0.01),而miR-27b NC組(1.00±0.08)變化無統計學差異(P>0.05)。

2.4轉染后SGC-7901細胞增殖比較 在轉染48 h和72 h后,miR-34a mimic組SGC-7901細胞活性較空白對照A組顯著下降(P<0.01),miR-34a NC組與空白對照A組細胞活性之間的差異無統計學意義(P>0.05)。miR-27b mimic組細胞活性較空白對照B組也顯著下降(P<0.01),miR-27b NC組與空白對照B組之間的變化無統計學意義(P>0.05),見表1。miR-34a mimic組〔(43.46±2.23)%〕細胞活性較空白對照A組〔(81.38±4.6)%〕顯著下降(P<0.01),miR-34a NC組〔(79.36±4.6)%〕與空白對照A組細胞活性之間的差異無統計學意義(P>0.05)。與空白對照B組〔(62.1±4.5)%〕比較,miR-27b mimic組細胞活性〔(24.86±2.1)%〕顯著下降(P<0.01),而miR-27b NC組(59.36±4.6%)變化無統計學差異(P>0.05),見圖2。

表1 各組細胞增殖、遷移與侵襲及SGC-7901細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量比較

圖2 各組細胞增殖活性(EdU染色,×100)

2.5轉染后SGC-7901細胞遷移與侵襲比較 與空白對照A組比較,miR-34a mimic組細胞遷移與侵襲數目均顯著減少(P<0.01),miR-34a NC組細胞遷移與侵襲數目變化無統計學意義(P>0.05)。與空白對照B組比較,miR-27b mimic組細胞遷移與侵襲數目均顯著減少(P<0.01),miR-27b NC組與空白對照B組細胞的遷移與侵襲數目無統計學差異(P>0.05),見表1、圖3。

圖3 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲(結晶紫染色,×100)

2.6轉染后細胞上清液VEGF、VEGFR2水平比較與空白對照A組比較,miR-34a mimic組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量均顯著降低(P<0.01),miR-34a NC組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量較空白對照A組的變化無統計學意義(P>0.05);與空白對照B組比較,miR-27b mimic組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量也均顯著降低(P<0.01),miR-27b NC組細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量較空白對照B組的變化無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.7miR-34a、miR-27b靶向VEGF關系驗證 通過TargetScan7預測發現,miR-34a、miR-27b均與VEGF 3′-UTR在特定區域存在堿基互補現象,見圖4。雙熒光素酶報告實驗結果顯示,與miR-34a NC和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組比較,miR-34a mimic和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組的相對熒光值顯著降低(P<0.01);同樣,miR-27b mimic和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組的相對熒光值較miR-27b NC和WT-VEGF 3′-UTR重組質粒共轉染組顯著降低(P<0.01),見表2。

表2 各組SGC-7901細胞相對熒光值比較

圖4 miR-34a、miR-27b與VEGF 3′-UTR靶向結合位點

2.8轉染后細胞KDR/FLK-1蛋白表達比較 miR-34a mimic組SGC-7901細胞中KDR、FLK-1蛋白表達較空白對照A組中顯著降低(P<0.01),miR-34a NC組與空白對照A組的KDR、FLK-1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。miR-27b mimic組細胞中KDR、FLK-1蛋白表達較空白對照B組中顯著降低(P<0.01),miR-27b NC組與空白對照B組中兩種蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05),見圖5、表3。

表3 Western印跡檢測細胞中KDR、FLK-1蛋白表達

1～6:空白對照A組、miR-34a NC組、miR-34a mimic組、空白對照B組、miR-27b NC組、miR-27b mimic組

2.9各處理組靜脈內皮細胞的成管結果比較 與空白對照A組〔(36.38±4.73)個〕比較,miR-34a mimic組細胞形成小管數目〔(17.46±1.84)個〕顯著減少(P<0.01),miR-34a NC組細胞小管數目〔(35.17±6.16)個〕無統計學差異(P>0.05)。miR-27b mimic組中細胞形成小管數目〔(9.87±1.35)個〕較空白對照B組〔(29.10±3.95)個〕顯著減少(P<0.01),miR-34a NC組〔(30.13±4.68)個〕與空白對照B組的細胞小管數目之間無統計學差異(P>0.05),見圖6。

圖6 各組靜脈內皮細胞成管情況(×100)

3 討 論

胃癌的病理過程涉及各種基因、因子和信號途徑參與,遺傳變異導致正常細胞的結構和功能發生不可逆轉的變化,最終導致癌變發生。胃癌發展有多個步驟,且這些步驟已通過病理和流行病學研究確定,在大多數情況下,最初階段是慢性胃炎,其次發展為胃萎縮和胃黏膜腸化生細胞變性,最終發展為胃癌〔2〕?；蜻z傳、吸煙、飲酒和不良飲食習慣均可能引發胃癌。目前,病理學診斷、物理學診斷和血清學檢查是常規的癌癥診斷方法〔11〕,隨著醫療技術的進步,出現了以細胞變化為中心的基因診斷方法,旨在早期檢測出從正常表型細胞轉化為癌細胞的證據。

目前,miRNA已成為一類新型潛在生物標志物用于微創診斷和疾病監測中。miR-34a和miR-27b是多種腫瘤進展的獨立預測因子。miR-34a表達水平與肝癌、乳腺癌、結直腸癌、膀胱癌的惡性程度呈負相關,miR-34a下調后削減了P53介導的促進細胞凋亡作用。此外,miR-34a還可以通過靶向相關分子來影響癌細胞的增殖和侵襲,例如Shen等〔12〕不僅證明了miR-34a在喉鱗狀細胞癌中的低表達,而且發現轉染miR-34a mimic可以通過靶向下調survivin蛋白顯著抑制細胞的增殖,使細胞發生G0/G1階段阻滯;Geng等〔13〕研究發現,過表達miR-34a可通過靶向調節E2F3和存活素(survivin)的表達來降低人乳頭瘤病毒陽性宮頸癌細胞的生存能力和轉移能力。miR-27b也在多種癌癥類型中起著復雜的作用,調節一系列生物學過程;Zhang等〔14〕研究發現miR-27b在非小細胞肺癌中表達水平降低,通過靶向鋅指轉錄因子(Snail)1發揮抑癌作用,以抑制肺癌的生長和上皮間質轉化。已有研究表明,miR-27b在胃癌組織和細胞中均下調,而TNM分期較高且腫瘤較大的患者組織中miR-27b表達水平較低,miR-27b能夠通過靶向核受體亞家族2F組成員(NR2F)2抑制胃癌轉移〔15〕。本研究結果同樣顯示,miR-34a與miR-27b在胃癌組織中呈低表達,通過轉染mimic在胃癌細胞中過表達miR-34a與miR-27b后可顯著抑制腫瘤細胞增殖與轉移。由此進一步表明,miR-34a與miR-27b可能在胃癌進程中起著抑癌基因的作用。

胃癌組織中強大的血管生成能力顯著促進了腫瘤的生長與轉移過程,這也是胃癌具有高死亡率的重要原因之一,鑒定胃癌血管生成的分子機制并研發新的抗血管生成靶標藥物對于患者來說意義重大。

研究表明,腫瘤細胞中VEGF與其受體VEGFR2結合后會激活酪氨酸激酶,促進受體磷酸化和相關信號轉導機制來刺激血管生成,從而增強組織中的血管生長并維持血液供應〔9,16〕。腫瘤細胞分泌的VEGF以旁分泌的方式通過與內皮細胞上VEGFR相互作用而刺激血管生成。然而,源自腫瘤細胞的VEGF也起自分泌因子的作用以調節細胞一系列生物學行為〔17〕。

本研究結果顯示,VEGF在胃癌組織中高表達,而在胃癌細胞中轉染miR-34a mimic或miR-27b mimic后,細胞上清液中VEGF與VEGFR2含量降低。結合生物信息學軟件預測和雙熒光素酶報告分析得到miR-34a與miR-27b靶向調控VEGF表達。目前,已發現多個miRNA通過靶向VEGF發揮作用,例如:miR-101通過抑制環氧化物酶(COX)-2衍生的前列腺素(PG)E2信號傳導靶向VEGF來抑制膽管癌的血管生成〔18〕;miR-182-5p通過靶向VEGF并抑制細胞外信號調節激酶(ERK)和蛋白激酶B(AKT)信號通路,以此調節血管生成和淋巴管生成來抑制結腸癌腫瘤的生長〔19〕。本研究結果顯示,轉染miR-34a mimic或miR-27b mimic的細胞中KDR、FLK-1蛋白表達水平降低,HUVECs細胞形成小管數目減少。由此推測,miR-34a 與miR-27b通過靶向VEGF/VEGFR2軸來發揮抑制血管生成的作用。

綜上所述,miR-34a與miR-27b在胃癌組織中低表達,兩者能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移與侵襲,并且具有抑制血管內皮細胞小管形成的能力。VEGF是miR-34a與miR-27b的共同靶標基因,miR-34a與miR-27b可能通過調控VEGF/VEGFR2軸發揮相關抑制作用。miR-34a與miR-27b可能為胃癌潛在的治療靶點,本研究為以后該疾病的診治研究提供新的切入點。