VEGF/VEGFR2通路在牙髓血運重建術模型大鼠牙髓血管新生中的作用

王芹 李立恒 王鐘華

(河北北方學院附屬第一醫院口腔科,河北 張家口 075000)

牙髓血運重建術(REPs)為治療年輕恒牙根尖周病的新方法,該術可刺激根尖周損傷并誘導血液進入根管,促進牙根繼續發育〔1〕。近年來,因齲齒或者外傷等原因導致的年輕恒牙牙髓病和根尖周病的發病率逐年上升,REPs誘導血管新生、促進牙髓修復再生、治療牙髓病和根尖周病的潛在作用越來越受到臨床研究的重視〔2〕。但REPs在細胞因子水平的研究少見,其促進牙髓血管再生修復的具體分子生物學機制也不甚明確。血管內皮細胞生長因子(VEGF)是一種促血管生成最強烈的細胞因子,可與VEGF受體(VEGFR)2結合調控相關基因轉錄表達,參與炎癥反應、創傷愈合及組織器官生長發育等過程〔3〕。但VEGF/VEGFR2是否參與調控牙髓血管再生促進牙髓組織修復過程還不明確。本研究通過在根管顯微鏡下建立大鼠磨牙牙髓血管再生術動物模型,探討VEGF/VEGFR2的動態表達及定位情況,推測其在牙髓血管再生術后修復中的價值。

1 材料與方法

1.1動物 取雄性SD大鼠25只,體質量250～280 g,鼠齡2～3個月,口腔衛生狀況良好,無齲齒及牙周疾病,動物合格證號為SCXK(渝)2017-006。飼養于河北北方學院附屬第一醫院動物房內。本研究由河北北方學院附屬第一醫院動物倫理委員審核批準〔審批號:IACUC-01(20160917)〕。

1.2主要試劑與儀器 胰蛋白酶〔貨號:abs47047375,愛必信(上海)生物科技有限公司〕;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號:R20570,廠家:上海源葉生物科技有限公司);VEGF(貨號:ab69479)、VEGFR(貨號:ab39638)、骨橋蛋白(OPN,貨號:ab8448)、整合素(αv)β3(貨號:ab119365)抗體(美國abcam公司);蛋白電泳儀(型號1658033,美國Bio-Rad公司)。

1.3模型構建與分組 隨機將25只大鼠分為正常對照組、根尖周炎組、REPs術后7、14、28 d組,根尖周炎模型建立及REPs參照文獻〔4〕進行。將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后,仰臥固定,用30 ml/L的飽和過氧化氫液棉球清潔口腔,750 mg/L乙醇消毒雙側磨牙區,取左右兩側下頜第一磨牙放置吸唾管,全程保持無菌操作。在根管顯微鏡下用高速不銹鋼1/4球鉆從大鼠下頜第一磨牙的牙合面近中窩向下鉆磨開髓,用#6、#8K銼疏通根管,并去除根管內牙髓,生理鹽水沖洗根管后取出K銼,建立根尖周炎模型。REPs:在第一磨牙開髓、去髓后,用生理鹽水沖洗殘留牙髓組織,再用針刺激根尖出血,棉球(無菌)輕壓止血,待凝固后將血凝塊表面用三氧化物多聚體(MTA)覆蓋,并充填流動樹脂;術后注意實驗動物保暖,待其蘇醒后,正常進水進食。正常對照組不做處理。正常對照組及根尖周組于術后28 d取材,REPs各組于術后7、14、28 d取材進行實驗。

1.4組織標本采集 麻醉處死大鼠,分離下頜骨,取左側下頜骨標本置于4%多聚甲醛中固定24 h。右側下頜骨標本取牙根尖周組織,置于液氮中保存。

1.5CT影像學觀察 左側下頜骨標本固定24 h后置于專用掃描管中,將牙體長軸平行與管長軸放置,調定掃描電壓為70 kV,功率30 W,電流429 μA,用顯微CT成像系統進行斷層掃描15 min獲得斷面成像,用于后續觀察分析。

1.6HE染色觀察大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周組織病理學變化 左側下頜骨標本做完CT成像后,標本用400 g/L甲酸脫鈣處理(可針刺穿透),梯度乙醇脫水、石蠟包埋后,連續切4 μm厚切片,行HE染色,光學顯微鏡下觀察組織病理形態學。

1.7免疫組化染色檢測大鼠第一磨牙牙根尖及牙根尖周組織VEGF表達 取1.6中石蠟切片,烤箱烘烤2 h,常規脫蠟、水化、3%過氧化氫滅活、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復、5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉后,加入一抗VEGF抗體(1∶500)孵育過夜,室溫下與羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h后,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染;封片后于光鏡下觀察并拍照,Image Pro Plus5.0軟件分析VEGF陽性表達的平均光密度值。

1.8各組第一磨牙牙根尖周組織腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β水平檢測 取1.4中液氮中保存的部分牙根尖組織,4 ℃下解凍后加生理鹽水研磨制備組織勻漿液,離心取上清,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.9Western印跡檢測牙根尖周組織VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表達 提取牙根尖組織總蛋白,測定蛋白濃度后,電泳分離50 μg蛋白樣品并轉膜,室溫下將膜封閉2 h后,4 ℃冰箱中與一抗VEGFR2(1∶500)、OPN(1∶500)、αvβ3(1∶500)、β-肌動蛋白(actin,1∶2 000)孵育過夜,室溫下與羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h后,增強化學發光法顯影,Image J軟件分析蛋白表達量。

1.10統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組一般狀況 各組試驗期間均存活,試驗牙周及根尖周外黏膜無明顯紅腫,牙體均無折裂或充填物脫落情況。

2.2各組牙根尖及牙根尖周組織CT影像學檢查結果 正常對照組牙根發育完善,根尖孔閉合;根尖周炎組牙髓腔開放,根管壁薄,根尖孔未閉合呈開放狀;REPs術后7 d組牙髓腔較大,根管壁薄;REPs術后14 d組根管壁增粗,牙髓腔縮窄,根尖稍膨大;REPs術后28 d組,根管口閉合,管壁增厚,有新生高密度硬組織形成,見圖1。

圖1 各組牙根尖及牙根尖周組織CT影像(×100)

2.3各組牙根尖及牙根尖周組織形態變化 正常對照組根管內可見疏松的結締組織,根尖牙周膜區為致密結締組織及大量的纖維、血管和細胞分布;根尖周炎組根管內含壞死物質,根尖周炎性細胞浸潤明顯,根管內未見新生組織形成;REPs術后7 d組根管內有少量不規則礦化基質和致密結締組織生成,根尖區周圍聚集著少量炎癥細胞和幼稚的成纖維細胞;REPs術后14 d組根管內有大量不規則礦化基質和致密結締組織生成,根尖區附近細胞有進入根管的趨勢;REPs術后28 d組根管內可見大量內含血管的新生結締組織,根管壁增厚,根尖部膨大,根尖孔縮小,見圖2。

圖2 各組牙根尖及牙周膜組織(HE染色,×200)

2.4各組根尖周組織VEGF表達 深棕色為VEGF強陽性表達。正常對照組VEGF在根尖周組織中呈弱陽性表達;根尖周炎組VEGF在根尖孔炎性細胞浸潤區呈強陽性表達;REPs術后7 d組VEGF在根尖周增生的成纖維細胞中呈強陽性表達;REPs術后14 d組及28 d組VEGF在根尖周骨組織骨細胞與吸收的陷窩內呈強陽性表達。見圖3。與正常組對照相比,其他各組VEGF陽性表達均顯著升高;與根尖周炎組相比,REPs術后7、14、28 d組VEGF陽性表達均顯著升高;與術后7 d組相比,REPs術后14、28 d組,VEGF陽性表達均顯著升高(均P<0.05),見表1。

表1 各組牙根尖及牙根尖周組織VEGF、TNF-α、IL-1β、VEGFR2、OPN、αvβ3表達水平比較

圖3 各組根尖周組織VEGF表達(免疫組化,×400)

2.5各組根尖周組織TNF-α、IL-1β水平 與正常對照組相比,根尖周炎組TNF-α、IL-1β水平顯著升高;與根尖周炎組相比,REPs術后7、14、28 d組上述指標水平顯著降低;與REPs術后7 d組相比,REPs術后14、28 d組上述指標均顯著降低;與REPs術后14 d組相比,REPs術后28 d組上述指標均顯著降低(均P<0.05),見表1。

2.6各組根尖周組織中VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表達情況 與正常對照組相比,根尖周炎組根尖周組織VEGFR2蛋白表達顯著升高,OPN、αvβ3蛋白表達均顯著降低(均P<0.05);與根尖周炎組相比,REPs術后7、14、28 d組VEGFR2、OPN、αvβ3蛋白表達均顯著增高;與REPs術后7 d組相比,REPs術后14、28 d組上述指標均顯著升高(均P<0.05),見表1、圖4。

1～5:正常對照組、根尖周炎組、REPs術后7 d組、REPs術后14 d組、REPs術后28 d組

3 討 論

由于牙根發育不完全、根管壁薄、根尖孔呈敞開狀態年輕恒牙易受各種侵害,致使牙髓壞死、牙根發育受限、根尖開放、根部脆弱甚至脫落,嚴重影響患者咬合功能〔5〕。年輕恒牙的根管治療一直是牙醫工作的難題〔6〕,研究發現,REPs術可通過刺激根尖部出血誘導根尖周干細胞遷移和分化,恢復牙髓活力再生及牙根生長發育〔7〕。研究證實大鼠上頜第一磨牙牙根可在第15天開始發育,25～30 d發育完成〔8〕,而REPs可在28 d左右完成牙周膜的修復〔9〕。本研究隨著REPs治療時間延長,大鼠根管壁逐漸增粗、牙髓腔逐漸縮窄、牙根尖逐漸膨大閉合,根尖周組織炎癥細胞逐漸減少,成纖維細胞逐漸增多,根管內礦化基質和致密結締組織逐漸生成,至術后28 d時根管內有新生結締組織、血管樣結構生成,根尖區附近有骨樣細胞沉積,另外根尖周組織TNF-α、IL-1β水平逐漸降低且接近正常值,提示REPs術后大鼠牙周組織炎癥水平降低,牙根管逐漸閉合生長,牙髓組織逐漸修復,與研究〔10〕REPs術后人類年輕恒牙放射影像學研究一致,證實REPs可用于恒牙根尖周病的治療,但其治療的分子機制還不甚明確。

血管生成是促進傷口愈合的關鍵步驟,也是牙齒修復過程中牙髓血管生成的前提條件〔11〕。研究證實,在牙髓損傷修復過程,牙本質基質釋放VEGF,形成牙本質-牙髓復合體,促進牙髓再生〔12〕。牙髓修復過程中的VEGF可能來源于根尖周組織中的間充質干細胞〔13,14〕,提示VEGF可能在牙髓血管生成修復過程中起重要作用。本研究提示,REPs術促進牙根生長及牙髓再生的作用可能與促進根尖周組織中VEGF表達有關。

VEGF主要通過受體VEGFR2進行傳導并調控血管生成及細胞的增殖遷移,研究證實,VEGF-VEGFR2可通過局部黏著斑激酶(FAK)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路調控人牙髓干細胞遷移,促進炎癥牙髓組織的修復〔15〕。張映娟等〔9〕發現,無髓年輕恒牙REPs術后在牙根管及根尖內檢測到骨組織沉積及根尖閉合趨勢,提示REPs術促進牙根閉合及牙根生長的作用,也可能與促進牙髓干細胞骨組織沉積有關。史欣等〔16〕發現,OPN誘導液可促進牙髓干細胞向成骨分化,證實OPN在骨礦化、代謝及重建過程中發揮重要作用。另外,OPN除是成骨分化誘導因子外,還是一種黏附因子〔17〕,研究證實,OPN不僅可通過αvβ3受體介導細胞黏附,形成酸性環境,促進細胞移行和擴散〔18〕,還可通過VEGF促進血管生成〔19〕。αvβ3也可介導破骨細胞與纖維蛋白結合,參與血管內皮細胞黏附、破骨細胞分化、成熟過程,促進破骨細胞通過血管系統在骨組織聚集〔20〕。本研究推測,根尖周組織具有成骨分化及遷移的因子作用較弱可能是恒牙牙根停止發育的關鍵因素。本研究表明REPs術可通過激活VEGF/VEGFR2通路,促進牙根尖周組織及牙髓組織血管再生,上調OPN、αvβ3蛋白表達,誘導成骨分化及遷移,促進牙根生長及牙髓再生。

本研究為闡明REPs促進牙根生長及牙髓再生的分子機制提供一定參考,但VEGF/VEGFR2信號通路靶分子較多,牙髓再生及牙根生長的分子機制復雜多樣,REPs術后牙髓再生及牙根生長的機制,有待進一步驗證。