CHIP介導的OGG1在老年性白內障發展過程中作用

唐靜 陽帆 周麗麗 袁小波

(湘潭市第一人民醫院 1醫學轉化中心,湖南 湘潭 411100;2營養科;3湖南交通工程學院護理學院)

老年性白內障是主要致盲性疾病之一,隨著老年人口的快速增加,白內障患病率進一步提升,在降低患者生存質量的同時加重了社會醫療負擔〔1〕。由于老年性白內障的病因尚未闡明,導致藥物療效不佳,臨床治療仍以手術為主〔2〕。研究發現,晶狀體蛋白質變性會影響正常的折射功能,引發不同程度的晶狀體混濁〔3〕。泛素化是蛋白質翻譯后修飾的主要方式,其中E3連接酶與底物蛋白的特異性密切相關,因此在調控泛素化過程中的作用最明顯〔4,5〕。相關研究已證實,老齡大鼠晶狀體上皮細胞中存在DNA損傷和DNA修復酶活性下降,提示DNA氧化損傷及修復障礙可能參與老年性白內障的發生與發展〔6〕。研究報道顯示,8-氧代鳥嘌呤-DNA糖基化酶(OGG)1參與晶狀體上皮細胞的DNA修復過程,在白內障病情發展中起關鍵作用〔7〕。但關于OGG1蛋白翻譯后修飾的研究仍十分少見。本研究探討熱休克蛋白70羰基末端反應蛋白(CHIP)介導的OGG1在老年性白內障發展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 SRA01/04永生化人晶狀體上皮細胞株購于上海弘順生物有限公司;RPMI1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購于百草泰克(北京)生物科技有限公司;手持中波紫外線檢測燈購于蘇州圣光儀器有限公司;CHIP蛋白過表達質粒由北京博云華康基因科技有限公司設計合成;兔抗人CHIP單克隆抗體,鼠抗人OGG1單克隆抗體,鼠抗人β-actin單克隆抗體,辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG均購于銘修(上海)生物科技有限公司。

1.2細胞培養及氧化損傷模型建立 將SRA01/04永生化人晶狀體上皮細胞取出,放入37 ℃恒溫水浴箱中解凍,之后2 000 r/min離心15 min,離心半徑10 cm,將上清液棄去,加入新鮮的RPMI1640完全培養基(含10%胎牛血清、10 g/L青鏈霉素),接種到細胞培養瓶中,在37 ℃ 5%CO2的培養箱中繼續孵育,每24～48 h換液,顯微鏡下觀察細胞密度超過80%時,使用Hanks平衡鹽溶液洗滌細胞,加入磷酸緩沖液,用手持中波紫外線檢測燈在30 cm處照射。將細胞分為對照組和模型組,根據照射時間將模型組進一步分成5個亞組(0、10、20、30、40 min),中波紫外線照射時間結束后,更換新鮮的RPMI1640完全培養基繼續培養24 h。

1.3細胞轉染與分組 將SRA01/04永生化人晶狀體上皮細胞接種到6孔板中,37 ℃ 5%CO2培養箱中培養,顯微鏡下觀察細胞密度超過70%時進行實驗。分為空白對照組、空載體質粒轉染組、CHIP過表達質粒轉染組,培養孔中加入試劑體積為VOpti-MEM∶V脂質體3000∶Vp3000=250 μl∶70 μl∶10 μl,之后再加入轉染質粒3 μg混合均勻,室溫條件下靜置20 min。放入37 ℃ 5%CO2的培養箱中孵育6 h,之后更換為RPMI1640完全培養基(含10%胎牛血清、10 g/L青鏈霉素)繼續孵育72 h。再建立細胞氧化損傷模型,設為細胞氧化損傷模型組。

1.4免疫沉淀實驗 向細胞培養液中加入免疫沉淀裂解液(20 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽,100 mmol/L氯化鈉溶液,1% Triton X-100溶液),分離蛋白質上清液。免疫沉淀實驗分組如下:IgG組、OGG1組、CHIP組,使用OGG1抗體沉淀下與OGG1抗體結合的蛋白,使用CHIP抗體沉淀下與CHIP抗體結合的蛋白;每組取500 μg蛋白,加入1 μl相對應的抗體后放于搖床上過夜。次日使用磁力架提取抗體蛋白復合物,進行Western印跡實驗;同時從未經免疫沉淀實驗處理的細胞總蛋白組中取40 μl蛋白原液檢測內源性蛋白表達。

1.5Western印跡檢測OGG1、CHIP蛋白表達 將細胞放于冰上,磷酸緩沖液充分洗滌后加入RIPA細胞裂解液200 μl,冰上裂解提取細胞總蛋白,使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白的上樣量,行10%十二烷基硫酸鈉 (SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白,電泳參數為80 V、120 min;電轉法將目標蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,用封閉液在室溫條件下封閉2 h。按照抗體說明書配制一抗稀釋液并滴加:兔抗人CHIP單克隆抗體(稀釋度:1∶1 000),鼠抗人OGG1單克隆抗體(稀釋度:1∶400),鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋度:1∶2 000),放入4 ℃冰箱中過夜。次日加入HRP標記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG,均為1∶5 000稀釋,室溫孵育2 h,洗滌后顯影,記錄各條帶的灰度值。

1.6統計學分析 采用SPSS24.0軟件,實驗數據均符合正態分布,多組間比較行方差分析,兩兩比較行LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1晶狀體上皮細胞中OGG1蛋白的泛素化修飾及E3泛素連接酶的預測 免疫沉淀實驗結果顯示,晶狀體上皮細胞中存在OGG1蛋白的泛素化修飾;使用人類泛素連接酶與底物相互作用的預測和展示系統UbiBrowser分析顯示,CHIP可能是引發OGG1泛素化修飾的E3泛素連接酶。 Western印跡檢測結果顯示,CHIP能夠與OGG1相互結合,提示OGG1可能參與OGG1蛋白的泛素化修飾過程。見圖1。

圖1 Western印跡檢測CHIP與OGG1的相互作用

2.2不同中波紫外線照射時間晶狀體上皮細胞中CHIP蛋白表達 與中波紫外照射0 min(1.04±0.02)相比,10、20、30、40 min CHIP蛋白質相對表達量分別為0.82±0.06、1.37±0.10、1.85±0.08、2.64±0.15,差異均有統計學意義(P<0.05)。10 min時,CHIP蛋白相對表達量明顯低于其他中波紫外線照射時間,20～40 min時,隨著照射時間增加,CHIP蛋白相對表達量逐漸增加,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同中波紫外線照射時間晶狀體上皮細胞中CHIP蛋白表達

2.3CHIP蛋白過表達模型驗證 CHIP過表達質粒轉染組晶狀體上皮細胞中CHIP蛋白相對表達量(1.48±0.03)明顯高于細胞氧化損傷模型組(0.95±0.01)和空載體質粒轉染組(0.93±0.01)和空白對照組(0.96±0.01,P<0.05);CHIP蛋白相對表達量在空載體質粒轉染組與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

1～4:空白對照組、細胞氧化損傷模型組、空載體質粒轉染組、CHIP過表達質粒轉染組;下圖同

2.4各組OGG1蛋白表達水平比較 與空白對照組(1.04±0.03)相比,細胞氧化損傷模型組OGG1蛋白相對表達量(4.76±0.27)明顯升高(P<0.01);CHIP過表達質粒轉染組(3.58±0.24)明顯低于細胞氧化損傷模型組和空載體質粒轉染組(4.92±0.30,P<0.05);細胞氧化損傷模型組與+空載體質粒轉染組OGG1蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組晶狀體上皮細胞中OGG1蛋白表達

3 討 論

老年性白內障的發生、發展受中波紫外線照射、氧化損傷等多種因素影響〔8〕。研究顯示,中波紫外線照射是老年性白內障發展過程中的主要環境因素〔9〕。晶狀體上皮細胞通過吸收大量中波紫外線引發一系列分子改變,包括DNA氧化損傷、細胞周期改變及泛素化等蛋白質翻譯后修飾等,破壞了晶狀體上皮細胞中功能蛋白質的穩定性,導致蛋白質的錯誤折疊〔10〕。研究報道顯示,在神經退行性病變等年齡相關性疾病的發生與發展過程中,中波紫外線照射、自由基等氧化應激狀態均會引發DNA損傷修復信號通路相關因子無法被泛素化及時降解,抑制對受損DNA的修復〔11〕;同時上述因子還會引發蛋白毒性,干擾細胞的正常生理過程。泛素蛋白酶系統包括底物蛋白泛素化、泛素標記蛋白降解兩個過程,是真核細胞清除錯誤折疊蛋白的主要手段之一〔12〕。泛素蛋白酶體系統包括E1、E2、E3及去泛素化酶和蛋白酶,形成過程主要包括:在腺嘌呤核苷三磷酸供能的基礎上,E1與泛素C端的殘基特異性結合后激活泛素,之后E1轉移到E2生成中間產物,E2與不同類型的E3共同形成泛素化修飾〔13〕。在上述過程中,E3能夠識別底物蛋白并聚集E2,在蛋白質泛素化修飾調控過程中發揮重要作用。

CHIP屬于胞質蛋白,具有E3泛素連接酶活性,可經泛素蛋白酶途徑促使CHIP底物發生泛素化修飾,包括氨基端TRR區、羧基端U-box區、中間功能區3個功能域,維持人體正常蛋白水平,降解突變蛋白或錯誤折疊蛋白,在維持細胞正常功能中發揮重要作用〔14〕。本研究說明CHIP可能參與調控晶狀體上皮細胞的氧化損傷過程。

研究發現,CHIP通過靶向降解P21、P57等DNA損傷修復蛋白,影響細胞周期過程,抑制惡性腫瘤的發生與發展〔15〕。亦有研究發現,OGG1是DNA堿基切除修復過程中的重要調控蛋白〔16〕。本研究確定CHIP能夠與OGG1相互結合,提示OGG1可能參與OGG1蛋白的泛素化修飾過程,并提示氧化損傷早期晶狀體上皮細胞中CHIP高表達,OGG1蛋白表達下調,抑制損傷DNA的修復,促進老年性白內障的發生與發展。